Biljni i patogeni materijali
Populaciju za mapiranje asocijacije sirka, poznatu kao populacija konverzije sirka (SCP), obezbijedio je dr. Pat Brown sa Univerziteta Illinois (sada na UC Davis). Prethodno je opisana i predstavlja skup različitih linija konvertovanih u neosjetljivost na fotoperiod i manji rast kako bi se olakšao rast i razvoj biljaka u okruženjima SAD-a. U ovoj studiji korišteno je 510 linija iz ove populacije, iako zbog loše klijavosti i drugih problema s kontrolom kvalitete, nisu sve linije korištene u analizi sve tri osobine. Konačno, podaci iz 345 linija korišteni su za analizu odgovora na hitin, 472 linije za odgovor na flg22 i 456 za otpornost na TLS.B. cookeiSoj LSLP18 je dobijen od dr. Burta Bluhma sa Univerziteta u Arkansasu.
Mjerenje MAMP odgovora
U ovoj studiji korištena su dva različita MAMP-a flg22 (Genscript katalog # RP19986) i hitin. Biljke sirka uzgajane su u umetcima postavljenim na ravnim površinama napunjenim zemljom (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) u stakleniku. Biljke su zalijevane dan prije uzimanja uzorka kako bi se izbjegla dodatna vlaga listova na dan uzimanja.
Linije su bile randomizirane i, iz logističkih razloga, zasađene su u serijama od po 60 linija. Za svaku liniju, zasađene su tri "saksije" sa po dvije sjemenke po liniji. Naknadne serije su zasađene čim je prethodna serija obrađena sve dok se ne procijeni cijela populacija. Dva eksperimentalna ciklusa su provedena za oba MAMP-a sa genotipovima ponovo randomiziranim u svakom od dva ciklusa.
ROS testovi su provedeni kao što je prethodno opisano. Ukratko, za svaku liniju, šest sjemenki je posađeno u 3 različite saksije. Od rezultirajućih sadnica, tri su odabrane na osnovu ujednačenosti. Sadnice koje su izgledale neobično ili su bile značajno više ili niže od većine nisu korištene. Četiri diska lista promjera 3 mm izrezana su iz najšireg dijela 4. lista tri različite biljke sirka stare 15 dana. Jedan disk po listu od dvije biljke i dva diska od jedne biljke, pri čemu je drugi disk postao kontrola s vodom (vidi dolje). Diskovi su pojedinačno plutali na 50 µl H20 u crnoj ploči s 96 jažica, zatvoreni aluminijskim zatvaračem kako bi se izbjeglo izlaganje svjetlosti i čuvani na sobnoj temperaturi preko noći. Sljedećeg jutra pripremljen je reakcijski rastvor koristeći 2 mg/ml hemiluminiscentne sonde L-012 (Wako, kataloški broj 120-04891), 2 mg/ml peroksidaze iz hrena (tip VI-A, Sigma-Aldrich, kataloški broj P6782) i 100 mg/ml hitina ili 2 μM Flg22. 50 µl ovog reakcijskog rastvora dodano je u tri od četiri jažice. Četvrta jažica je bila lažna kontrola, kojoj je dodan reakcijski rastvor bez MAMP-a. U svaku ploču su također uključene četiri slijepe jažice koje su sadržavale samo vodu.
Nakon dodavanja reakcijske otopine, luminiscencija je mjerena korištenjem SynergyTM 2 multi-detection mikrotitarskog čitača ploča (BioTek) svake 2 minute tokom 1 sata. Čitač ploča vrši mjerenja luminiscencije svake 2 minute tokom ovog 1 sata. Zbir svih 31 očitanja izračunat je kako bi se dobila vrijednost za svaku rupicu. Procijenjena vrijednost MAMP odgovora za svaki genotip izračunata je kao (prosječna vrijednost luminiscencije tri eksperimentalna rupice - vrijednost u simuliranoj rupici) - minus prosječna vrijednost u praznoj rupici. Vrijednosti u praznoj rupici bile su konzistentno blizu nule.
Listni diskoviNicotiana benthamiana, jedna linija sirka s visokim odzivom (SC0003) i jedna linija sirka s niskim odzivom (PI 6069) također su uključene kao kontrole u svaku ploču s 96 jažica u svrhu kontrole kvalitete.
B. cookeipriprema inokuluma i inokulacija
B. cookeiInokulum je pripremljen kako je prethodno opisano. Ukratko, zrna sirka su natopljena u vodi tri dana, isprana, prebačena u konusne tikvice od 1 litre i autoklavirana sat vremena na 15 psi i 121 °C. Zrna su zatim inokulirana sa oko 5 ml maceriranog micelija iz svježe kultureB. cookeiIzolati LSLP18 i ostavljeni 2 sedmice na sobnoj temperaturi, protresajući tikvice svaka 3 dana. Nakon 2 sedmice, zrna sirka zaražena gljivicom osušena su na zraku, a zatim pohranjena na 4 °C do inokulacije na polju. Isti inokulum korišten je tokom cijelog ispitivanja i svake godine se pripremao svjež. Za inokulaciju, 6-10 zaraženih zrna stavljeno je u pršljen biljaka sirka starih 4-5 sedmica. Spore proizvedene od ovih gljivica pokrenule su infekciju kod mladih biljaka sirka u roku od sedmice.
Priprema sjemena
Prije sadnje u polje, sjeme sirka tretirano je mješavinom fungicida, insekticida i zaštitnih sredstava koja sadrži ~ 1% fungicida Spirato 480 FS, 4% fungicida Sebring 480 FS i 3% zaštitnih sredstava za sjeme Sorpro 940 ES. Zatim je sjeme sušeno na zraku 3 dana, što je osiguralo tanak sloj ove mješavine oko sjemena. Zaštitno sredstvo je omogućilo upotrebu herbicida Dual Magnum kao tretmana prije nicanja.
Evaluacija otpornosti na ciljanu pjegavost lišća
SCP je zasađen u Centralnoj istraživačkoj stanici za usjeve u Claytonu, NC, 14. i 15. juna 2017. i 20. juna 2018. godine po randomiziranom dizajnu potpunog bloka sa dva eksperimentalna ponavljanja u svakom slučaju. Eksperimenti su zasađeni u pojedinačnim redovima širine 1,8 m sa širinom reda od 0,9 m, koristeći 10 sjemenki po parceli. Dva granična reda zasađena su oko periferije svakog eksperimenta kako bi se spriječili rubni efekti. Eksperimenti su inokulirani 20. jula 2017. i 20. jula 2018. godine, kada su biljke sirka bile u fazi rasta 3. Ocjene su vršene na skali od jedan do devet, gdje su biljke koje nisu pokazivale znakove bolesti ocijenjene kao devet, a potpuno mrtve biljke kao jedan. Dvije ocjene su izvršene 2017. godine, a četiri očitanja 2018. godine, počevši dvije sedmice nakon inokulacije svake godine. sAUDPC (standardizirana površina ispod krive progresije bolesti) izračunata je kao što je prethodno opisano.
Vrijeme objave: 01.04.2021.