Pesticidi igraju ključnu ulogu u rješavanju globalne nestašice hrane i borbi protiv vektorskih ljudskih bolesti. Međutim, rastući problem otpornosti na pesticide hitno zahtijeva otkriće novih spojeva koji ciljaju nedovoljno iskorištene ciljeve. Kanali prolaznog receptorskog potencijala insekata (TRPV) - Nanzhong (Nan) i inaktivni (Iav) - mogu formirati heterologne kanale (Nan-Iav) i lokalizirati se na mehanosenzorne organe koji posreduju geotropizam, sluh i propriocepciju kod insekata. Neki pesticidi, poput afidopirolidona (AP), ciljaju Nan-Iav putem nepoznatih mehanizama. AP je efikasan protiv insekata koji probadaju i sišu (hemiptera), sprječavajući hranjenje ometanjem funkcije filamenata. AP se može vezati samo za Nan, ali samo Nan-Iav može interagovati sa agonistima, uključujući endogeni nikotinamid (NAM), čime pokazuje aktivnost kanala. Uprkos potencijalu Nan-Iav kao cilja insekticida, malo se zna o njegovom sastavljanju kanala, regulatornim mjestima vezivanja i regulaciji zavisnoj od Ca2+, što ometa daljnji razvoj insekticida. U ovoj studiji, krioelektronska mikroskopija je korištena za određivanje strukture Nan-Iav kod insekata Hemiptera u stanju bez kalmodulin-liganda, kao i sa AP i NAM na granici citoplazmatskog domena ankirinskih ponavljanja (ARD). Iznenađujuće, otkrili smo da sam Nan protein može formirati pentamer, koji je stabilizovan AR-posredovanim interakcijama. Ova studija otkriva molekularne interakcije između insekticida i agonista i Nan-Iav, ističući važnost ARD u funkciji i sastavljanju kanala, te istražujući mehanizam regulacije Ca2+.
U kontekstu sve ozbiljnijih globalnih klimatskih promjena, pogoršanje globalne sigurnosti hrane jedan je od glavnih izazova 21. stoljeća, s kaskadnim posljedicama za društvo.1,2Izvještaj Svjetske zdravstvene organizacije o stanju sigurnosti hrane i ishrani u svijetu za 2023. godinu (SOFI) procjenjuje da približno 2,33 milijarde ljudi širom svijeta pati od umjerene do teške nesigurnosti u pogledu hrane, što je dugogodišnji problem.3,4Nažalost, procjenjuje se da se 20% do 30% ili više prinosa usjeva godišnje gubi zbog štetočina i patogena, a očekuje se da će globalno zagrijavanje pogoršati otpornost na štetočine i ranjivost usjeva.4, 5, 6, 7, 8Razvoj pesticida je ključan ne samo za zaštitu usjeva od štetočina i smanjenje širenja vektorskih patogena, već i za borbu protiv vektorskih ljudskih bolesti poput denge, malarije i Chagasove bolesti, koje su sve otpornije na pesticide.5, 9, 10, 11
Među glavnim metama neurotoksičnih insekticida, heterotetramerni TRPV kanal Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) predstavlja klasu meta insekticida otkrivenih tek u posljednjoj deceniji, uključujući komercijalno dostupne insekticide poput imidakloprida i piraklostrobina.12, 13, 14Polusintetički insekticid afidopirolifen (AP) je nedavno razvijen i komercijalizirani proizvod čija je glavna komponenta aktivni insekticid Inscalis®, koji veže AP na subnanomolarnom nivou aktivnosti.15AP pokazuje nisku akutnu toksičnost za oprašivače, korisne insekte i druge organizme kojima sredstvo nije namijenjeno, a kada se koristi prema uputama na etiketi, može smanjiti otpornost na druge insekticide.16, 17, 18Nan i Iav su široko rasprostranjeni među vrstama insekata, koeksprimiraju se samo u neuronima receptora istezanja akorda antena i udova, te su ključni za sluh, percepciju gravitacije i propriocepciju.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidakloprid i piraklostrobin stimulišu Nan-Iav kompleks putem jedinstvenog mehanizma, što u konačnici inhibira proprioceptivnu transdukciju signala.13, 16, 23Kod insekata koji probadaju i sišu (hemiptera) kao što su lisne uši i bijele mušice, gubitak propriocepcije oštećuje njihovu sposobnost hranjenja, što na kraju dovodi do smrti.13,24Zanimljivo je da AP pokazuje visok afinitet za Nan-Iav kompleks i nizak afinitet za sam Nan. Vezivanje AP-a za Nan-Iav indukuje električnu struju, ali vezivanje za Nan sam ne stimuliše aktivnost kanala. Sam Iav se uopšte ne veže za AP.16Ovo ukazuje na to da se Nan i Iav mogu vezati formirajući različite Nan-Iav kanalske komplekse (npr. sa različitim stehiometrijskim omjerima ili različitim rasporedima unutar istog stehiometrijskog omjera) ili da se AP može vezati za više mjesta. Nadalje, prirodni agonist nikotinamid (NAM) se veže za Drosophila Nan-Iav sa mikromolarnim afinitetom, pokazujući efekte slične onima kod lisnih uši (AP) in vitro.16,25i inhibiranje razmnožavanja i hranjenja lisnih uši, što na kraju dovodi do njihove smrti25,26Ovi podaci postavljaju mnoga pitanja. Na primjer, ostaje nejasno kako se formira Nan-Iav heterodimer, koja mjesta vezivanja se koriste za modulaciju malih molekula i kako ovi mali molekuli regulišu funkciju kanala potiskivanjem propriocepcije. Nadalje, razlozi zašto je sam Nan neaktivan i ima nizak afinitet za AP, dok je Nan-Iav heterodimer aktivan i veže AP s većim afinitetom, ostaju nejasni. Konačno, malo se zna o Ca2+-zavisnoj regulaciji Nan-Iav funkcije i kako je ona integrirana u procese neuronske signalizacije.13,21
U ovoj studiji, kombinujući krioelektronsku mikroskopiju, elektrofiziologiju i tehnike vezivanja radioliganda, razjasnili smo sastavljanje Nan-Iav i mehanizam njegovog vezivanja za regulatore malih molekula. Nadalje, detektovali smo konstitutivno vezan kalmodulin (CaM) za Iav i AP-stabilizovane Nan pentamere. Ovi rezultati pružaju važne uvide u regulaciju kalcijumskih iona u kanalima, sastavljanje kanala i faktore koji određuju afinitet vezivanja liganda. Što je još važnije, potvrdili smo da ARD igra centralnu ulogu u ovim procesima. Naša studija kompletnih kanala insekata vezanih za relevantne poljoprivredne pesticide...27, 28, 29otvara perspektive za razvoj industrije pesticida, poboljšavajući efikasnost i specifičnost pesticida i omogućavajući primjenu TRPV-ciljanih spojeva na druge vrste kako bi se riješila globalna sigurnost hrane i širenje vektorski prenosivih bolesti.
Također smo otkrili da je Nan-Iav reguliran Ca2+, a mehanizam regulacije posredovan je konstitutivno vezanim CaM. Važno je napomenuti da se ova Ca2+-ovisna regulacija Nav pomoću CaM značajno razlikuje od mehanizama regulacije drugih ionskih kanala (npr. naponski kontroliranih Na+ kanala i TRPV5/6 kanala).52, 53, 54, 55, 56, 57U Nav1.2 kanalu, C-terminalni domen CaM se spiralno povezuje sa C-terminalnim domenom (CTD), a Ca2+ indukuje vezivanje svog N-terminalnog domena za distalni dio CTD-a.56U TRPV5/6 kanalu, C-terminalni domen CaM se veže za CTH, a Ca2+ indukuje proširenje svog N-terminalnog domena prema gore u poru, čime blokira permeabilnost kationa.53,54Predlažemo model za Ca2+-reguliranu funkciju Nan-Iav-CaM (Sl. 4h). U ovom modelu, N-terminalni domen CaM konstitutivno se veže za C-terminalni domen (CTH) Iav. U stanju mirovanja (niska koncentracija [Ca2+]), C-terminalni domen CaM interaguje sa Nan-om, stabilizujući ARD konformaciju i time podstičući otvaranje kanala. Vezivanje agonista/insekticida za kanal indukuje otvaranje pora, što dovodi do priliva Ca2+. Ca2+ se zatim veže za CaM, uzrokujući disocijaciju C-terminalnog domena od ARD-a Nan-a. Budući da blokiranje vezivanja CaM u suštini ukida inhibitorni efekat Ca2+, ova disocijacija modulira ARD pokretljivost, čime uzrokuje Ca2+-zavisnu inhibiciju ili desenzibilizaciju. Brzi oporavak struja kanala nakon elucije kalcijum jona (Sl. 4g) sugeriše da ovaj mehanizam olakšava brze odgovore na Ca2+-posredovane neuronske signale. Nadalje, za C-terminalnu regiju proteina Iav, koja je još uvijek slabo istražena, utvrđeno je da igra i druge uloge u ciljanju kanala i regulaciji struje.21
Konačno, naša studija predstavlja strukturu visoke rezolucije insekticid-insekticidnog TRP kanalskog kompleksa od poljoprivrednog značaja - otkriće koje nam ranije nije bilo poznato. Značajno je da smo okarakterizirali strukturu i funkciju insekticidnog kanala u ljudskim ćelijama (HEK293S GnTi–) umjesto u ćelijama insekata. Suočeni s rastućom otpornosti na insekticide i kontinuiranim pritiskom na sigurnost hrane i patogene, naš rad pruža važne informacije koje će olakšati razvoj novih insekticida u korist ljudskog zdravlja i globalne sigurnosti hrane. Studije su pokazale da su insekticidi poput AP efikasni protiv nekih štetočina kada se koriste prema uputama na etiketi i imaju nisku akutnu toksičnost za korisne oprašivače, što pokazuje njihovu sigurnost za okoliš.13,16Nadalje, testiranje nekih AP derivata na komarcima pokazalo je da oni na kraju gube sposobnost letenja. Razumijevanje načina na koji se ovi modulirajući spojevi vežu za Nan-Iav olakšat će modifikaciju postojećih spojeva ili razvoj novih spojeva za efikasnije i...precizansuzbijanje štetočina. Naša studija pokazuje da je Nan-Iav ARD interfejs ključan ne samo za regulaciju aktivnosti endogenih spojeva, pesticida i Ca2+-CaM, već i za sastavljanje kanala. Predlažemo da bi narušavanje sastavljanja heterodimera malim molekulima moglo biti jedinstven i obećavajući pristup za razvoj inhibitora jonskih kanala.
Od osam ortolognih gena, odabrani su geni pune dužine smeđe bube (Halyomorpha halys) Nanchung i Inactive, koji pokazuju odličnu stabilnost u deterdžentima. Sintetizirani geni su kodonski optimizirani za ljudsku ekspresiju i klonirani u pBacMam pCMV-DEST vektor (Life Technologies) korištenjem restrikcijskih mjesta XhoI i EcoRI. Ovo je osiguralo da su klonovi u okviru sa C-terminalnim GFP-FLAG-10xHis i mCherry-FLAG-10xHis oznakama, koje cijepa HRC-3C proteaza (PPX), omogućavajući nezavisno...izrazPrajmeri korišteni za kloniranje Nanchunga i Inactivea u pBacMam vektor bili su sljedeći:
Mikroskopske slike pojedinačnih čestica dobijene su na Titan Krios G2 transmisionom elektronskom mikroskopu (FEI) opremljenom K3 kamerom i Gatan BioQuantum energetskim filterom. Mikroskop je radio na 300 keV, sa postavkom energije od 20 eV, veličinom piksela uzorka od 1,08 Å/piksel (nominalno uvećanje od 81.000x) i gradijentom defokusiranja u rasponu od -0,8 do -2,2 μm. Snimanje videa je izvršeno pri 40 kadrova u sekundi korištenjem Latitude S mikroskopa (Gatan) sa nominalnom brzinom doze od 25 e–px−1 s−1, vremenom ekspozicije od 2,4 s i ukupnom dozom od približno 60 e–Å−2.
Korekcija kretanja izazvanog snopom i ponderiranje doze izvršeni su na filmu korištenjem MotionCor2 u RELION 4.061. Procjena parametra funkcije prijenosa kontrasta (CTF) izvršena je u cryoSPARC-u korištenjem metode procjene CTF-a zasnovane na zakrpama62. Fotomikrografije s rezolucijom CTF prilagođavanja ≥4 Å isključene su iz naknadne analize. Tipično, podskup od 500-1000 fotomikrografija korišten je za odabir tačaka u cryoSPARC-u, nakon čega je uslijedilo nekoliko rundi 2D klasifikacije nakon filtriranja kako bi se dobila jasna referentna slika za odabir čestica na osnovu predloška. Čestice su zatim ekstrahirane korištenjem 64-pikselnih graničnih okvira i 4-strukog binninga. Izvršeno je nekoliko rundi 2D klasifikacije kako bi se uklonile neželjene kategorije čestica. Početni 3D model rekonstruiran je korištenjem ab initio rekonstrukcije i usavršen korištenjem neuniformnog usavršavanja u cryoSPARC-u. 3D klasifikacija je izvršena u cryoSPARC-u ili RELION-u na osnovu heterogenosti ARD-a. Nije uočena značajna heterogenost membranskih domena. Čestice su usavršene korištenjem C1 i C2 metoda; Čestice sa većom C2 rezolucijom smatrane su simetričnima u odnosu na C2 i uvezene su u RELION radi Bayesovog preciziranja. Čestice su zatim vraćene u cryoSPARC radi konačnog neuniformnog i lokalnog preciziranja. Konačna rezolucija i broj čestica prikazani su u Tabeli 1.
Prilikom obrade Nan+AP pentamera, istražili smo različite metode za poboljšanje rezolucije membranskih domena (posebno regije pora), kao što su oduzimanje signala i maskiranje TMD-a. Međutim, ovi pokušaji nisu bili uspješni zbog potencijalno ekstremnog poremećaja u regiji pora i ukupne heterogenosti TMD-a. Konačna rezolucija je izračunata korištenjem maske automatski generirane metodom neuniformne obrade u cryoSPARC-u, prvenstveno ciljajući ARD regiju. Ovim je postignuta znatno veća rezolucija od membranskih domena (posebno VSLD regije).
Početni de novo modeli apo oblika Nanchung i Inactive bakterija prvo su generirani korištenjem Coot63, a modeli Nan i Iav bakterija generirani su korištenjem AlphaFold264 za identifikaciju regija niske pouzdanosti. Modeliranje kalmodulina zasnovano je na prilagođavanjima krutog tijela modela vezivanja Ca2+ i bez Ca2+ u PDB pristupima 4JPZ56 i 1CFD65, respektivno. Modeli su profinjeni korištenjem sfernog profinjenja kako bi se osigurala ispravna stereohemija i dobra geometrija. Fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin i fosfatidilserin su zatim modelirani kao dobro definirane gustoće lipida, a NAM i AP ligandi su smješteni u odgovarajuće gustoće u čvrstim spojevima. Datoteke ograničenja generirane su iz SMILES niza izoformi korištenjem eLBOW u PHENIX66. Konačno, modeli su profinjeni u stvarnom prostoru u PHENIX korištenjem lokalnog pretraživanja mreže i globalne minimizacije s ograničenjima sekundarne strukture. MolProbity server je korišten za usavršavanje modela i strukturnu analizu, a ilustracije su izvršene korištenjem PyMOL-a i UCSF Chimera X-a. 67,68,69 Analiza otvora blende je izvršena korištenjem HOLE servera,70 a mapiranje očuvanja sekvenci je izvršeno korištenjem Consurf servera.71
Statistička analiza je provedena korištenjem programa Igor Pro 6.2, Excel Office 365 i GraphPad Prism 7.0. Svi kvantitativni podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna greška (SEM). Za poređenje dvije grupe korišten je Studentov t-test (dvostrani, nespareni). Za poređenje više grupa korištena je jednosmjerna analiza varijanse (ANOVA), a zatim Dunnettov post hoc test. *P< 0,05, **P< 0,01 i ***PVrijednosti < 0,001 smatrane su statistički značajnim ovisno o distribuciji podataka. Vrijednosti Kd i Ki, kao i njihovi asimetrični intervali pouzdanosti od 95% izračunati su pomoću programa GraphPad Prism 10.
Za više detalja o metodologiji studije, pogledajte Sažetak izvještaja o prirodnom portfoliju, na koji se odnosi link u ovom članku.
Početni model je izgrađen korištenjem kalmodulinskih modela iz baza podataka PDB 4JPZ i 1CFD. Koordinate su pohranjene u Banci podataka o proteinima (PDB) pod pristupnim brojevima 9NVN (Nan-Iav-CaM bez liganda), 9NVO (Nan-Iav-CaM vezan za nikotinamid), 9NVP (Nan-Iav-CaM vezan za nikotinamid i EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM vezan za afenidolpirolin i kalcij), 9NVR (Nan-Iav-CaM vezan za afenidolpirolin i EDTA) i 9NVS (Nan pentamer vezan za afenidolpirolin). Odgovarajuće slike dobijene krio-elektronskom mikroskopijom pohranjene su u Bazi podataka elektronske mikroskopije (EMDB) pod sljedećim pristupnim brojevima: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM bez liganda), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM kompleks sa nikotinamidom), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM kompleks sa nikotinamidom i EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM kompleks sa afidopirolinom i kalcijem), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM kompleks sa afidopirolinom i EDTA) i EMD-49849 (Nan pentamer kompleks sa afidopirolinom). Sirovi podaci za funkcionalnu analizu predstavljeni su u ovom radu.
Vrijeme objave: 28. januar 2026.