Antihelmintički lijek N,N-dietil-m-toluamid (DEET) inducira angiogenezu kroz alosterijsku modulaciju muskarinskih M3 receptora u endotelnim stanicama.

  
Antihelmintički lijek N,N-dietil-m-toluamid (DEET) prijavljeno je da inhibira AChE (acetilkolinesterazu) i da ima potencijalna kancerogena svojstva zbog pretjerane vaskularizacije. U ovom radu pokazujemo da DEET specifično stimulira endotelne stanice koje potiču angiogenezu, čime se povećava rast tumora. DEET aktivira stanične procese koji vode do angiogeneze, uključujući proliferaciju, migraciju i adheziju. Ovo je povezano sa povećanom proizvodnjom NO i ekspresijom VEGF u endotelnim ćelijama. Utišavanje M3 ili korištenje farmakoloških inhibitora M3 uklonili su sve ove efekte, sugerirajući da je DEET-indukovana angiogeneza osjetljiva na M3. Eksperimenti koji uključuju signalizaciju kalcijuma u endotelnim i HEK ćelijama koje prekomerno eksprimiraju M3 receptore, kao i studije vezivanja i spajanja, pokazuju da DEET deluje kao alosterički modulator M3 receptora. Nadalje, DEET inhibira AChE, čime se povećava bioraspoloživost acetilholina i njegovo vezivanje za M3 receptore, te pojačavaju proangiogene efekte putem alosterične regulacije.
Primarni EC su izolovani iz aorte švajcarskih miševa. Metoda ekstrakcije je prilagođena iz Kobayashi protokola 26 . Mišji EC su kultivisani u medijumu EBM-2 dopunjenom sa 5% toplotno inaktiviranim FBS do četvrtog pasusa.
Učinak dvije koncentracije DEET-a na proliferaciju HUVEC, U87MG ili BF16F10 analiziran je korištenjem CyQUANT kompleta za ispitivanje proliferacije ćelija (Molecular Probes, C7026). Ukratko, 5,103 ćelije po jažici zasađeno je u ploču sa 96 jažica, ostavljeno da se pričvrsti preko noći, a zatim tretirano DEET-om 24 h. Nakon uklanjanja medijuma za rast, dodajte rastvor koji vezuje boju u svaku jažicu mikroploče i inkubirajte ćelije na 37 °C 30 minuta. Nivoi fluorescencije određivani su korištenjem Mithras LB940 multimodnog čitača mikroploča (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Njemačka) opremljenog filterima ekscitacije od 485 nm i emisionim filterima od 530 nm.
HUVEC su posađene u ploče sa 96 jažica sa gustinom od 104 ćelije po jažici. Ćelije su tretirane DEET-om 24 h. Vijabilnost ćelija je procenjena kolorimetrijskim MTT testom (Sigma-Aldrich, M5655). Vrijednosti optičke gustoće dobivene su na multimodnom čitaču mikroploča (Mithras LB940) na talasnoj dužini od 570 nm.
Efekti DEET-a su proučavani pomoću in vitro testova angiogeneze. Tretman sa 10-8 M ili 10-5 M DEET povećao je formiranje dužine kapilara u HUVEC-ima (sl. 1a, b, bijele trake). U poređenju sa kontrolnom grupom, tretman sa koncentracijama DEET u rasponu od 10-14 do 10-5 M pokazao je da je dužina kapilara dostigla plato na 10-8 M DEET (dodatna slika S2). Nije nađena značajna razlika u in vitro proangiogenom efektu HUVEC-a tretiranih DEET-om u rasponu koncentracija od 10-8 M i 10-5 M.
Da bismo utvrdili učinak DEET-a na neovaskularizaciju, izveli smo in vivo studije neovaskularizacije. Nakon 14 dana, miševi kojima su ubrizgane endotelne ćelije prethodno kultivirane sa 10-8 M ili 10-5 M DEET pokazali su značajno povećanje sadržaja hemoglobina (slika 1c, bijele trake).
Nadalje, DEET-indukovana neovaskularizacija proučavana je kod miševa koji su nosili ksenotransplantat U87MG koji su svakodnevno (ip) ubrizgavali DEET u dozi za koju je poznato da inducira koncentraciju u plazmi od 10-5 M, što je normalno kod izloženih ljudi. u 23. Tumori koji se mogu detektovati (tj. tumori >100 mm3) uočeni su 14 dana nakon injekcije ćelija U87MG u miševe. Dana 28, rast tumora je značajno pojačan kod miševa tretiranih DEET-om u poređenju sa kontrolnim miševima (Slika 1d, kvadrati). Nadalje, CD31 bojenje tumora pokazalo je da DEET značajno povećava površinu kapilara, ali ne i gustinu mikrožila. (Sl. 1e–g).
Da bi se odredila uloga muskarinskih receptora u DETA-indukovanoj proliferaciji, korišćeno je 10-8 M ili 10-5 M DETA u prisustvu pFHHSiD (10-7 M, selektivni antagonist M3 receptora). Liječenje HUVEC-a. pFHHSiD je potpuno blokirao proliferativna svojstva DETA u svim koncentracijama (Tabela 1).
U ovim uslovima, takođe smo ispitali da li će DEET povećati dužinu kapilara u HUVEC ćelijama. Slično, pFHHSiD je značajno spriječio DEET-indukovanu dužinu kapilara (sl. 1a, b, sive trake). Nadalje, slični eksperimenti su izvedeni sa M3 siRNA. Iako kontrolna siRNA nije bila efikasna u promociji formiranja kapilara, utišavanje M3 muskarinskog receptora je ukinulo sposobnost DEET-a da poveća dužinu kapilara (sl. 1a, b, crne trake).
Nadalje, i 10-8 M ili 10-5 M DEET-indukovana vaskularizacija in vitro i neovaskularizacija in vivo bile su potpuno blokirane pFHHSiD (sl. 1c, d, kružići). Ovi rezultati pokazuju da DEET promovira angiogenezu putem puta osjetljivog na selektivne antagoniste M3 receptora ili M3 siRNA.
AChE je molekularna meta DEET-a. Lijekovi kao što je donepezil, koji djeluju kao AChE inhibitori, mogu stimulirati EC angiogenezu in vitro i na modelima ishemije stražnjih udova miša14. Testirali smo učinak dvije koncentracije DEET-a na aktivnost enzima AChE u HUVEC-u. Niske (10-8 M) i visoke (10-5 M) koncentracije DEET su smanjile endotelnu aktivnost AChE u poređenju sa kontrolnim uslovima (slika 2).
Obje koncentracije DEET-a (10-8 M i 10-5 M) su smanjile aktivnost acetilholinesteraze na HUVEC-u. BW284c51 (10-5 M) je korišten kao kontrola za inhibitore acetilholinesteraze. Rezultati su izraženi kao procenat aktivnosti AChE na HUVEC tretiranom sa dvije koncentracije DEET-a u poređenju sa ćelijama tretiranim nosačem. Vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± SEM šest nezavisnih eksperimenata. *p < 0,05 u poređenju sa kontrolom (Kruskal-Wallis i Dunn test višestrukog poređenja).
Dušikov oksid (NO) je uključen u angiogeni proces 33, stoga je proučavana proizvodnja NO u DEET-stimuliranim HUVEC-ima. DEET-tretirana endotelna produkcija NO je povećana u poređenju sa kontrolnim ćelijama, ali je dostigla značajnost tek pri dozi od 10-8 M (slika 3c). Da bi se odredile molekularne promjene koje kontroliraju DEET-indukovanu proizvodnju NO, ekspresija i aktivacija eNOS-a analizirani su Western blottingom. Iako tretman DEET-om nije promijenio ekspresiju eNOS-a, značajno je povećao fosforilaciju eNOS-a na njegovom aktivirajućem mjestu (Ser-1177) dok je smanjio njegovo inhibitorno mjesto (Thr-495) u poređenju sa netretiranim stanicama u fosforilaciji eNOS-a (slika 3d). Nadalje, omjer fosforiliranog eNOS-a na mjestu aktivacije i inhibicijskom mjestu izračunat je nakon normalizacije količine fosforiliranog eNOS-a prema ukupnoj količini enzima. Ovaj omjer je značajno povećan kod HUVEC-a tretiranih sa svakom koncentracijom DEET-a u poređenju sa netretiranim ćelijama (slika 3d).
Konačno, ekspresija VEGF-a, jednog od glavnih proangiogenih faktora, analizirana je Western blottingom. DEET je značajno povećao ekspresiju VEGF-a, dok je pFHHSiD potpuno blokirao ovu ekspresiju.
Pošto su efekti DEET-a osjetljivi i na farmakološku blokadu i na smanjenje regulacije M3 receptora, testirali smo hipotezu da DEET može poboljšati signalizaciju kalcijuma. Iznenađujuće, DEET nije uspio povećati citoplazmatski kalcij u HUVEC (podaci nisu prikazani) i HEK/M3 (Slika 4a, b) za obje korištene koncentracije.