Antihelmintski lijek N,N-dietil-m-toluamid (DEET) je zabilježeno da inhibira AChE (acetilholinesterazu) i ima potencijalna kancerogena svojstva zbog prekomjerne vaskularizacije. U ovom radu pokazujemo da DEET specifično stimuliše endotelne ćelije koje promoviraju angiogenezu, čime se povećava rast tumora. DEET aktivira ćelijske procese koji dovode do angiogeneze, uključujući proliferaciju, migraciju i adheziju. Ovo je povezano sa povećanom proizvodnjom NO i ekspresijom VEGF-a u endotelnim ćelijama. Utišavanje M3 ili korištenje farmakoloških M3 inhibitora ukinulo je sve ove efekte, što sugerira da je angiogeneza izazvana DEET-om osjetljiva na M3. Eksperimenti koji uključuju kalcijumsku signalizaciju u endotelnim i HEK ćelijama koje prekomjerno eksprimiraju M3 receptore, kao i studije vezivanja i spajanja, ukazuju na to da DEET djeluje kao alosterički modulator M3 receptora. Nadalje, DEET inhibira AChE, čime se povećava bioraspoloživost acetilholina i njegovo vezivanje za M3 receptore, te pojačavaju proangiogene efekte putem alosteričke regulacije.
Primarne EC su izolovane iz aorte švicarskih miševa. Metoda ekstrakcije je prilagođena Kobayashi protokolu 26. Mišje EC su kultivisane u EBM-2 medijumu dopunjenom sa 5% toplotno inaktiviranog FBS do četvrte pasaže.
Učinak dvije koncentracije DEET-a na proliferaciju HUVEC, U87MG ili BF16F10 analiziran je korištenjem CyQUANT kompleta za ispitivanje proliferacije ćelija (Molecular Probes, C7026). Ukratko, 5.103 ćelija po jažici je zasijano u ploču sa 96 jažica, ostavljeno da se pričvrsti preko noći, a zatim tretirano DEET-om tokom 24 sata. Nakon uklanjanja podloge za rast, dodaje se rastvor za vezivanje boje u svaku jažicu mikroploče i inkubira ćelije na 37 °C tokom 30 minuta. Nivoi fluorescencije su određeni korištenjem Mithras LB940 multimodnog čitača mikroploča (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Njemačka) opremljenog filterima za ekscitaciju od 485 nm i filterima za emisiju od 530 nm.
HUVEC su zasijane u ploče sa 96 jažica u gustini od 10⁴ ćelija po jažici. Ćelije su tretirane DEET-om tokom 24 sata. Ćelijska vijabilnost je procijenjena kolorimetrijskim MTT testom (Sigma-Aldrich, M5655). Vrijednosti optičke gustine su dobijene na multimodnom čitaču mikroploča (Mithras LB940) na talasnoj dužini od 570 nm.
Efekti DEET-a proučavani su korištenjem in vitro testova angiogeneze. Tretman sa 10-8 M ili 10-5 M DEET-a povećao je formiranje dužine kapilara u HUVEC-ima (Slika 1a, b, bijele trake). U poređenju sa kontrolnom grupom, tretman koncentracijama DEET-a u rasponu od 10-14 do 10-5 M pokazao je da je dužina kapilara dostigla plato pri 10-8 M DEET-a (Dopunska slika S2). Nije pronađena značajna razlika u in vitro proangiogenom efektu HUVEC-a tretiranih DEET-om u rasponu koncentracija od 10-8 M i 10-5 M.
Da bismo utvrdili učinak DEET-a na neovaskularizaciju, proveli smo in vivo studije neovaskularizacije. Nakon 14 dana, miševi kojima su ubrizgane endotelne ćelije prethodno kultivirane sa 10-8 M ili 10-5 M DEET-a pokazali su značajno povećanje sadržaja hemoglobina (Slika 1c, bijele trake).
Nadalje, proučavana je neovaskularizacija izazvana DEET-om kod miševa sa ksenograftom U87MG kojima je svakodnevno (ip) ubrizgavan DEET u dozi za koju se zna da indukuje koncentracije u plazmi od 10-5 M, što je normalno kod izloženih ljudi. u 23. Detektabilni tumori (tj. tumori >100 mm3) uočeni su 14 dana nakon injekcije U87MG ćelija u miševe. Na 28. dan, rast tumora je bio značajno pojačan kod miševa tretiranih DEET-om u poređenju sa kontrolnim miševima (Slika 1d, kvadrati). Nadalje, bojenje tumora CD31 pokazalo je da DEET značajno povećava površinu kapilara, ali ne i gustinu mikrovaskularnog sistema. (Slika 1e-g).
Da bi se utvrdila uloga muskarinskih receptora u proliferaciji izazvanoj DETA-om, korišteno je 10-8 M ili 10-5 M DETA u prisustvu pFHHSiD (10-7 M, selektivni antagonist M3 receptora). Tretman HUVEC-a pFHHSiD-om je potpuno blokirao proliferativna svojstva DETA-e pri svim koncentracijama (Tabela 1).
Pod ovim uslovima, također smo ispitali da li bi DEET povećao dužinu kapilara u HUVEC ćelijama. Slično tome, pFHHSiD je značajno spriječio dužinu kapilara izazvanu DEET-om (Slika 1a, b, sive trake). Nadalje, slični eksperimenti su provedeni sa M3 siRNA. Iako kontrolna siRNA nije bila efikasna u promovisanju formiranja kapilara, utišavanje M3 muskarinskog receptora ukinulo je sposobnost DEET-a da poveća dužinu kapilara (Slika 1a, b, crne trake).
Nadalje, i 10-8 M ili 10-5 M DEET-inducirana vaskularizacija in vitro i neovaskularizacija in vivo bile su potpuno blokirane pFHHSiD-om (Slika 1c, d, krugovi). Ovi rezultati ukazuju na to da DEET promovira angiogenezu putem puta osjetljivog na selektivne antagoniste M3 receptora ili M3 siRNA.
AChE je molekularna meta DEET-a. Lijekovi poput donepezila, koji djeluju kao inhibitori AChE, mogu stimulirati angiogenezu endotelnih ćelija in vitro i u modelima ishemije zadnjih udova miševa14. Testirali smo učinak dvije koncentracije DEET-a na aktivnost enzima AChE u HUVEC-ima. Niske (10-8 M) i visoke (10-5 M) koncentracije DEET-a smanjile su aktivnost endotelnog AChE u poređenju s kontrolnim uvjetima (Slika 2).
Obje koncentracije DEET-a (10-8 M i 10-5 M) smanjile su aktivnost acetilholinesteraze na HUVEC ćelijama. BW284c51 (10-5 M) je korišten kao kontrola za inhibitore acetilholinesteraze. Rezultati su izraženi kao procenat aktivnosti AChE na HUVEC ćelijama tretiranim sa dvije koncentracije DEET-a u poređenju sa ćelijama tretiranim nosačem. Vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± SEM šest nezavisnih eksperimenata. *p < 0,05 u poređenju sa kontrolom (Kruskal-Wallis i Dunn test višestruke komparacije).
Dušikov oksid (NO) je uključen u angiogene procese 33, stoga je proučavana produkcija NO u HUVEC ćelijama stimulisanim DEET-om. Produkcija endotelnog NO tretirana DEET-om bila je povećana u poređenju sa kontrolnim ćelijama, ali je dostigla značajnost tek pri dozi od 10-8 M (Sl. 3c). Da bi se odredile molekularne promjene koje kontrolišu proizvodnju NO indukovanu DEET-om, ekspresija i aktivacija eNOS-a analizirane su Western blottingom. Iako tretman DEET-om nije promijenio ekspresiju eNOS-a, značajno je povećao fosforilaciju eNOS-a na njegovom aktivacijskom mjestu (Ser-1177), dok je smanjio njegovo inhibitorno mjesto (Thr-495) u poređenju sa netretiranim ćelijama u fosforilaciji eNOS-a (Sl. 3d). Nadalje, odnos fosforiliranog eNOS-a na aktivacijskom i inhibitornom mjestu izračunat je nakon normalizacije količine fosforiliranog eNOS-a prema ukupnoj količini enzima. Ovaj odnos je značajno povećan u HUVEC ćelijama tretiranim svakom koncentracijom DEET-a u poređenju sa netretiranim ćelijama (Sl. 3d).
Konačno, ekspresija VEGF-a, jednog od glavnih proangiogenih faktora, analizirana je Western blottingom. DEET je značajno povećao ekspresiju VEGF-a, dok je pFHHSiD potpuno blokirao ovu ekspresiju.
Budući da su efekti DEET-a osjetljivi i na farmakološku blokadu i na smanjenje M3 receptora, testirali smo hipotezu da DEET može pojačati kalcijevu signalizaciju. Iznenađujuće, DEET nije uspio povećati citoplazmatski kalcij u HUVEC (podaci nisu prikazani) i HEK/M3 (Slika 4a, b) za obje korištene koncentracije.
Vrijeme objave: 30. decembar 2024.