U ovoj studiji, stimulativni efekti kombinovanog tretmanaregulatori rasta biljakaIspitan je utjecaj (2,4-D i kinetina) i nanočestica željeznog oksida (Fe₃O₄-NP) na in vitro morfogenezu i proizvodnju sekundarnih metabolita u *Hypericum perforatum* L. Optimizirani tretman [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NP (4 mg/L)] značajno je poboljšao parametre rasta biljaka: visina biljke povećana je za 59,6%, dužina korijena za 114,0%, broj pupoljaka za 180,0%, a svježa težina kalusa za 198,3% u poređenju s kontrolnom grupom. Ovaj kombinirani tretman također je poboljšao efikasnost regeneracije (50,85%) i povećao sadržaj hipericina za 66,6%. GC-MS analiza je otkrila visok sadržaj hiperozida, β-patolena i cetil alkohola, što čini 93,36% ukupne površine vrha, dok se sadržaj ukupnih fenola i flavonoida povećao za čak 80,1%. Ovi rezultati ukazuju na to da regulatori rasta biljaka (PGR) i Fe₃O₄ nanočestice (Fe₃O₄-NP) imaju sinergijski učinak stimulirajući organogenezu i akumulaciju bioaktivnih spojeva, što predstavlja obećavajuću strategiju za biotehnološko poboljšanje ljekovitog bilja.
Kantarion (Hypericum perforatum L.), također poznat kao kantarion, je višegodišnja zeljasta biljka iz porodice Hypericaceae koja ima ekonomsku vrijednost.[1] Njene potencijalne bioaktivne komponente uključuju prirodne tanine, ksantone, floroglucinol, naftalendiantron (hiperin i pseudohiperin), flavonoide, fenolne kiseline i eterična ulja.[2,3,4] Kantarion se može razmnožavati tradicionalnim metodama; međutim, sezonalnost tradicionalnih metoda, niska klijavost sjemena i osjetljivost na bolesti ograničavaju njen potencijal za uzgoj velikih razmjera i kontinuirano stvaranje sekundarnih metabolita.[1,5,6]
Stoga se in vitro kultura tkiva smatra efikasnom metodom za brzo razmnožavanje biljaka, očuvanje resursa germplazme i povećan prinos ljekovitih spojeva [7, 8]. Regulatori rasta biljaka (PGR) igraju ključnu ulogu u regulaciji morfogeneze i neophodni su za in vitro uzgoj kalusa i cijelih organizama. Optimizacija njihovih koncentracija i kombinacija ključna je za uspješan završetak ovih razvojnih procesa [9]. Stoga je razumijevanje odgovarajućeg sastava i koncentracije regulatora važno za poboljšanje rasta i regenerativnog kapaciteta kantariona (H. perforatum) [10].
Nanočestice željeznog oksida (Fe₃O₄) su klasa nanočestica koje su razvijene ili se razvijaju za kulturu tkiva. Fe₃O₄ ima značajna magnetska svojstva, dobru biokompatibilnost i sposobnost da podstakne rast biljaka i smanji stres iz okoliša, tako da je privukao značajnu pažnju u dizajnu kultura tkiva. Potencijalne primjene ovih nanočestica mogu uključivati optimizaciju in vitro kulture za podsticanje diobe ćelija, poboljšanje unosa hranjivih tvari i aktiviranje antioksidativnih enzima [11].
Iako su nanočestice pokazale dobre efekte podsticanja rasta biljaka, studije o kombinovanoj primjeni Fe₃O₄ nanočestica i optimizovanih regulatora rasta biljaka kod *H. perforatum* ostaju oskudne. Kako bi se popunila ova praznina u znanju, ova studija je procijenila efekte njihovih kombinovanih efekata na in vitro morfogenezu i proizvodnju sekundarnih metabolita kako bi pružila nove uvide za poboljšanje karakteristika ljekovitih biljaka. Stoga ova studija ima dva cilja: (1) optimizirati koncentraciju regulatora rasta biljaka kako bi se efikasno podstaklo formiranje kalusa, regeneracija izdanaka i ukorjenjivanje in vitro; i (2) procijeniti efekte Fe₃O₄ nanočestica na parametre rasta in vitro. Budući planovi uključuju procjenu stope preživljavanja regeneriranih biljaka tokom aklimatizacije (in vitro). Očekuje se da će rezultati ove studije značajno poboljšati efikasnost mikropropagacije *H. perforatum*, čime će doprinijeti održivoj upotrebi i biotehnološkoj primjeni ove važne ljekovite biljke.
U ovoj studiji, dobili smo eksplantate listova jednogodišnjih biljaka kantariona uzgojenih na polju (matične biljke). Ovi eksplantati su korišteni za optimizaciju uslova kulture in vitro. Prije kultivacije, listovi su temeljito isprani pod mlazom destilovane vode nekoliko minuta. Površine eksplantata su zatim dezinfikovane uranjanjem u 70% etanol tokom 30 sekundi, a zatim uranjanjem u 1,5% rastvor natrijum hipohlorita (NaOCl) koji sadrži nekoliko kapi Tween 20 tokom 10 minuta. Konačno, eksplantati su isprani tri puta sterilnom destilovanom vodom prije prenosa u sljedeći medij za kulturu.
Tokom sljedeće četiri sedmice, mjereni su parametri regeneracije izdanaka, uključujući brzinu regeneracije, broj izdanaka po eksplantatu i dužinu izdanka. Kada su regenerirani izdanci dostigli dužinu od najmanje 2 cm, prebačeni su u medij za ukorjenjivanje koji se sastojao od MS medija upola jače koncentracije, 0,5 mg/L indolbuterne kiseline (IBA) i 0,3% guar gume. Kultura ukorjenjivanja nastavljena je tri sedmice, tokom kojih su mjereni brzina ukorjenjivanja, broj korijena i dužina korijena. Svaki tretman je ponovljen tri puta, sa 10 eksplantata kultiviranih po ponavljanju, što je dalo približno 30 eksplantata po tretmanu.
Visina biljke mjerena je u centimetrima (cm) pomoću ravnala, od baze biljke do vrha najvišeg lista. Dužina korijena mjerena je u milimetrima (mm) odmah nakon pažljivog uklanjanja sadnica i uklanjanja supstrata za uzgoj. Broj pupoljaka po eksplantu prebrojan je direktno na svakoj biljci. Broj crnih mrlja na listovima, poznatih kao noduli, mjeren je vizualno. Vjeruje se da su ovi crni noduli žlijezde koje sadrže hipericin, ili oksidativne mrlje, i koriste se kao fiziološki indikator odgovora biljke na tretman. Nakon uklanjanja cijelog supstrata za uzgoj, svježa težina sadnica mjerena je pomoću elektronske vage s tačnošću od miligrama (mg).
Metoda za izračunavanje brzine formiranja kalusa je sljedeća: nakon kultiviranja eksplantata u mediju koji sadrži različite regulatore rasta (kinaze, 2,4-D i Fe3O4) tokom četiri sedmice, broji se broj eksplantata sposobnih za formiranje kalusa. Formula za izračunavanje brzine formiranja kalusa je sljedeća:
Svaki tretman je ponovljen tri puta, s najmanje 10 eksplantata pregledanih u svakom ponavljanju.
Stopa regeneracije odražava udio kalusnog tkiva koje uspješno završi proces diferencijacije pupoljaka nakon faze formiranja kalusa. Ovaj pokazatelj pokazuje sposobnost kalusnog tkiva da se transformiše u diferencirano tkivo i izraste u nove biljne organe.
Koeficijent ukorjenjivanja je odnos broja grana sposobnih za ukorjenjivanje i ukupnog broja grana. Ovaj pokazatelj odražava uspjeh faze ukorjenjivanja, što je ključno u mikropropagaciji i razmnožavanju biljaka, jer dobro ukorjenjivanje pomaže sadnicama da bolje prežive u uslovima uzgoja.
Spojevi hipericina ekstrahirani su s 90% metanolom. Pedeset mg osušenog biljnog materijala dodano je u 1 ml metanola i sonicirano 20 minuta na 30 kHz u ultrazvučnom čistaču (model A5120-3YJ) na sobnoj temperaturi u mraku. Nakon soniciranja, uzorak je centrifugiran na 6000 rpm tokom 15 minuta. Supernatant je sakupljen, a apsorbancija hipericina izmjerena je na 592 nm pomoću Plus-3000 S spektrofotometra prema metodi koju su opisali Conceiçao i suradnici [14].
Većina tretmana regulatorima rasta biljaka (PGR) i nanočesticama željeznog oksida (Fe₃O₄-NP) nije izazvala stvaranje crnih kvržica na regeneriranim listovima izdanaka. Kvržice nisu uočene ni u jednom od tretmana sa 0,5 ili 1 mg/L 2,4-D, 0,5 ili 1 mg/L kinetina ili 1, 2 ili 4 mg/L nanočesticama željeznog oksida. Nekoliko kombinacija pokazalo je blagi porast razvoja kvržica (ali ne i statistički značajan) pri višim koncentracijama kinetina i/ili nanočesticama željeznog oksida, kao što je kombinacija 2,4-D (0,5–2 mg/L) sa kinitinom (1–1,5 mg/L) i nanočesticama željeznog oksida (2–4 mg/L). Ovi rezultati su prikazani na Slici 2. Crne kvržice predstavljaju žlijezde bogate hipericinom, koje su i prirodno prisutne i korisne. U ovoj studiji, crne kvržice su uglavnom bile povezane sa smeđenjem tkiva, što ukazuje na povoljno okruženje za akumulaciju hipericina. Tretman sa 2,4-D, kinetinom i Fe₃O₄ nanočesticama podstakao je rast kalusa, smanjio tamnjenje i povećao sadržaj hlorofila, što ukazuje na poboljšanu metaboličku funkciju i potencijalno smanjenje oksidativnih oštećenja [37]. Ova studija je procijenila efekte kinetina u kombinaciji sa 2,4-D i Fe₃O₄ nanočesticama na rast i razvoj kalusa kantariona (Slika 3a-g). Prethodne studije su pokazale da Fe₃O₄ nanočestice imaju antifungalna i antimikrobna djelovanja [38, 39] i, kada se koriste u kombinaciji sa regulatorima rasta biljaka, mogu stimulisati odbrambene mehanizme biljaka i smanjiti indekse ćelijskog stresa [18]. Iako je biosinteza sekundarnih metabolita genetski regulisana, njihov stvarni prinos u velikoj mjeri zavisi od uslova okoline. Metaboličke i morfološke promjene mogu uticati na nivoe sekundarnih metabolita regulisanjem ekspresije specifičnih biljnih gena i reagovanjem na faktore okoline. Nadalje, induktori mogu pokrenuti aktivaciju novih gena, koji zauzvrat stimulišu enzimsku aktivnost, što u konačnici aktivira više biosintetskih puteva i dovodi do stvaranja sekundarnih metabolita. Nadalje, druga studija je pokazala da smanjenje zasjenjenja povećava izloženost sunčevoj svjetlosti, čime se povećavaju dnevne temperature u prirodnom staništu *Hypericum perforatum*, što također doprinosi povećanom prinosu hipericina. Na osnovu ovih podataka, ova studija je istražila ulogu nanočestica željeza kao potencijalnih induktora u kulturi tkiva. Rezultati su pokazali da ove nanočestice mogu aktivirati gene uključene u biosintezu hesperidina putem enzimske stimulacije, što dovodi do povećane akumulacije ovog spoja (Slika 2). Stoga, u poređenju s biljkama koje rastu u prirodnim uvjetima, može se tvrditi da se proizvodnja takvih spojeva in vivo također može poboljšati kada se umjereni stres kombinira s aktivacijom gena uključenih u biosintezu sekundarnih metabolita. Kombinirani tretmani općenito imaju pozitivan učinak na brzinu regeneracije, ali u nekim slučajevima ovaj učinak je oslabljen. Posebno je važno napomenuti da tretman sa 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kinaze i različitim koncentracijama može nezavisno i značajno povećati brzinu regeneracije za 50,85% u poređenju s kontrolnom grupom (Slika 4c). Ovi rezultati ukazuju na to da specifične kombinacije nanohormona mogu sinergijski djelovati kako bi potaknule rast biljaka i proizvodnju metabolita, što je od velikog značaja za kulturu tkiva ljekovitog bilja. Palmer i Keller [50] su pokazali da tretman sa 2,4-D može nezavisno izazvati stvaranje kalusa kod St. perforatum, dok dodatak kinaze značajno poboljšava stvaranje i regeneraciju kalusa. Ovaj efekat je posljedica poboljšanja hormonske ravnoteže i stimulacije diobe ćelija. Bal i saradnici [51] su otkrili da tretman sa Fe₃O₄-NP može nezavisno poboljšati funkciju antioksidativnih enzima, čime se podstiče rast korijena kod St. perforatum. Mediji za kulturu koji sadrže Fe₃O₄ nanočestice u koncentracijama od 0,5 mg/L, 1 mg/L i 1,5 mg/L poboljšali su brzinu regeneracije biljaka lana [52]. Upotreba kinetina, 2,4-diklorobenzotiazolinona i Fe₃O₄ nanočestica značajno je poboljšala brzinu stvaranja kalusa i korijena, međutim, potrebno je uzeti u obzir potencijalne nuspojave korištenja ovih hormona za regeneraciju in vitro. Na primjer, dugotrajna ili upotreba 2,4-diklorobenzotiazolinona ili kinetina u visokim koncentracijama može rezultirati somatskim klonskim varijacijama, oksidativnim stresom, abnormalnom morfologijom kalusa ili vitrifikacijom. Stoga, visoka stopa regeneracije ne mora nužno predviđati genetsku stabilnost. Sve regenerirane biljke treba procijeniti korištenjem molekularnih markera (npr. RAPD, ISSR, AFLP) ili citogenetske analize kako bi se utvrdila njihova homogenost i sličnost s biljkama in vivo [53,54,55].
Ova studija je prvi put pokazala da kombinovana upotreba regulatora rasta biljaka (2,4-D i kinetina) sa Fe₃O₄ nanočesticama može poboljšati morfogenezu i akumulaciju ključnih bioaktivnih metabolita (uključujući hipericin i hiperozid) u *Hypericum perforatum*. Optimizovani režim tretmana (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetina + 4 mg/L Fe₃O₄-NP) ne samo da je maksimizirao formiranje kalusa, organogenezu i prinos sekundarnih metabolita, već je pokazao i blagi indukujući efekat, potencijalno poboljšavajući toleranciju biljke na stres i njenu medicinsku vrijednost. Kombinacija nanotehnologije i kulture biljnog tkiva pruža održivu i efikasnu platformu za proizvodnju ljekovitih jedinjenja in vitro velikih razmjera. Ovi rezultati otvaraju put industrijskim primjenama i budućim istraživanjima molekularnih mehanizama, optimizacije doziranja i genetske preciznosti, čime se povezuju fundamentalna istraživanja ljekovitog bilja sa praktičnom biotehnologijom.
Vrijeme objave: 12. decembar 2025.