Rast apikalnog meristema (SAM) izdanka je ključan za arhitekturu stabljike. Biljni hormonigiberelini(GA) igraju ključnu ulogu u koordinaciji rasta biljaka, ali njihova uloga u SAM-u (samoustanskoj membrani) je još uvijek slabo shvaćena. Ovdje smo razvili ratometrijski biosenzor GA signalizacije inženjeringom PELL proteina kako bismo suzbili njegovu esencijalnu regulatornu funkciju u transkripcijskom odgovoru GA, a istovremeno sačuvali njegovu degradaciju nakon prepoznavanja GA. Pokazujemo da ovaj biosenzor zasnovan na degradaciji precizno bilježi promjene u nivoima GA i ćelijskom senzorstvu tokom razvoja. Koristili smo ovaj biosenzor za mapiranje aktivnosti GA signalizacije u SAM-u. Pokazujemo da su visoki GA signali prisutni pretežno u ćelijama koje se nalaze između primordija organa, koje su prekursori ćelija internodija. Koristeći pristupe dobitka i gubitka funkcije, dalje pokazujemo da GA reguliše orijentaciju ravni ćelijske diobe, uspostavljajući kanonsku ćelijsku organizaciju internodija, čime promovira specifikaciju internodija u SAM-u.
Apikalni meristem izdanka (SAM), smješten na vrhu izdanka, sadrži nišu matičnih ćelija čija aktivnost generira bočne organe i matične čvorove na modularan i iterativan način tokom cijelog života biljke. Svaka od ovih ponavljajućih jedinica, ili biljnih čvorova, uključuje internodije i bočne organe na čvorovima, te aksilarne meristeme u pazuhu lista1. Rast i organizacija biljnih čvorova mijenjaju se tokom razvoja. Kod Arabidopsis-a, rast internodija je potisnut tokom vegetativne faze, a aksilarni meristemi ostaju neaktivni u pazuhu listova rozete. Tokom prelaska u cvjetnu fazu, SAM postaje cvjetni meristem, generirajući izdužene internodije i aksilarne pupoljke, grančice u pazuhu stabljikastih listova, a kasnije i cvjetove bez listova2. Iako smo postigli značajan napredak u razumijevanju mehanizama koji kontroliraju inicijaciju lišća, cvjetova i grana, relativno malo se zna o tome kako nastaju internodiji.
Razumijevanje prostorno-vremenske distribucije GA pomoći će u boljem razumijevanju funkcija ovih hormona u različitim tkivima i u različitim razvojnim fazama. Vizualizacija degradacije RGA-GFP fuzije eksprimirane pod djelovanjem vlastitog promotora pruža važne informacije o regulaciji ukupnih nivoa GA u korijenu15,16. Međutim, ekspresija RGA varira u različitim tkivima17 i regulirana je pomoću GA18. Dakle, diferencijalna ekspresija RGA promotora može rezultirati fluorescentnim obrascem koji se opaža kod RGA-GFP i stoga ova metoda nije kvantitativna. Nedavno je bioaktivni fluoresceinom (Fl) obilježen GA19,20 otkrio akumulaciju GA u endokorteksu korijena i regulaciju njegovih ćelijskih nivoa putem transporta GA. Nedavno je GA FRET senzor nlsGPS1 pokazao da nivoi GA koreliraju s izduženjem ćelija u korijenu, filamentima i tamno uzgojenim hipokotilima21. Međutim, kao što smo vidjeli, koncentracija GA nije jedini parametar koji kontrolira aktivnost GA signalizacije, jer ovisi o složenim procesima osjećanja. Ovdje, nadograđujući naše razumijevanje signalnih puteva PELL i GA, izvještavamo o razvoju i karakterizaciji raciometrijskog biosenzora za GA signalizaciju zasnovanog na degradaciji. Za razvoj ovog kvantitativnog biosenzora, koristili smo mutantni RGA osjetljiv na GA koji je bio fuzioniran s fluorescentnim proteinom i sveprisutno eksprimiran u tkivima, kao i fluorescentni protein neosjetljiv na GA. Pokazujemo da fuzije mutiranih RGA proteina ne ometaju endogenu GA signalizaciju kada su sveprisutno eksprimirane, te da ovaj biosenzor može kvantificirati signalnu aktivnost koja proizlazi i iz GA ulaza i iz obrade GA signala od strane senzorskog aparata s visokom prostorno-vremenskom rezolucijom. Koristili smo ovaj biosenzor za mapiranje prostorno-vremenske distribucije GA signalne aktivnosti i kvantificiranje načina na koji GA reguliše ćelijsko ponašanje u SAM epidermi. Pokazujemo da GA reguliše orijentaciju ravni diobe SAM ćelija koje se nalaze između primordija organa, čime definiše kanonsku ćelijsku organizaciju internodija.
Konačno, pitali smo da li qmRGA može prijaviti promjene u endogenim nivoima GA korištenjem rastućih hipokotila. Prethodno smo pokazali da nitrat stimuliše rast povećanjem sinteze GA i, zauzvrat, degradacije PE34. Shodno tome, primijetili smo da je dužina hipokotila kod sadnica pUBQ10::qmRGA uzgajanih pod obilnom opskrbom nitratom (10 mM NO3−) bila značajno duža nego kod sadnica uzgajanih u uslovima nedostatka nitrata (Dopunska slika 6a). U skladu sa odgovorom rasta, GA signali su bili viši u hipokotilima sadnica uzgajanih pod uslovima 10 mM NO3− nego kod sadnica uzgajanih u odsustvu nitrata (Dopunska slika 6b, c). Dakle, qmRGA takođe omogućava praćenje promjena u GA signalizaciji izazvanih endogenim promjenama u koncentraciji GA.
Da bismo razumjeli da li GA signalna aktivnost detektovana pomoću qmRGA zavisi od koncentracije GA i percepcije GA, kako se i očekivalo na osnovu dizajna senzora, analizirali smo ekspresiju tri GID1 receptora u vegetativnim i reproduktivnim tkivima. Kod sadnica, GID1-GUS reporterska linija pokazala je da su GID1a i c visoko eksprimirani u kotiledonima (Slika 3a-c). Pored toga, sva tri receptora su eksprimirana u listovima, bočnim korijenskim primordijima, vrhovima korijena (osim korijenove kapice GID1b) i vaskularnom sistemu (Slika 3a-c). U cvasti SAM, detektovali smo GUS signale samo za GID1b i 1c (Dopunska slika 7a-c). In situ hibridizacija potvrdila je ove obrasce ekspresije i dalje pokazala da je GID1c jednoliko eksprimiran na niskim nivoima u SAM-u, dok je GID1b pokazao veću ekspresiju na periferiji SAM-a (Dopunska slika 7d-l). Translacijska fuzija pGID1b::2xmTQ2-GID1b također je otkrila stupnjevani raspon ekspresije GID1b, od niske ili nikakve ekspresije u centru SAM-a do visoke ekspresije na granicama organa (Dopunska slika 7m). Dakle, GID1 receptori nisu ravnomjerno raspoređeni po i unutar tkiva. U kasnijim eksperimentima, također smo primijetili da prekomjerna ekspresija GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) povećava osjetljivost qmRGA u hipokotilima na vanjsku primjenu GA (Slika 3d, e). Nasuprot tome, fluorescencija mjerena pomoću qd17mRGA u hipokotilu bila je neosjetljiva na tretman GA3 (Slika 3f, g). Za oba testa, sadnice su tretirane visokim koncentracijama GA (100 μM GA3) kako bi se procijenilo brzo ponašanje senzora, gdje je sposobnost vezivanja za GID1 receptor bila pojačana ili izgubljena. Zajedno, ovi rezultati potvrđuju da qmRGA biosenzor služi kombinovanoj funkciji kao GA i GA senzor, te sugerišu da diferencijalna ekspresija GID1 receptora može značajno modulirati emisivnost senzora.
Do danas, distribucija GA signala u SAM-u ostaje nejasna. Stoga smo koristili biljke koje eksprimiraju qmRGA i pCLV3::mCherry-NLS reporter matičnih ćelija35 kako bismo izračunali kvantitativne mape visoke rezolucije GA signalne aktivnosti, fokusirajući se na L1 sloj (epidermis; Slika 4a, b, vidi Metode i Dopunske metode), budući da L1 igra ključnu ulogu u kontroli rasta SAM-a36. Ovdje je ekspresija pCLV3::mCherry-NLS pružila fiksnu geometrijsku referentnu tačku za analizu prostorno-vremenske distribucije GA signalne aktivnosti37. Iako se GA smatra esencijalnim za razvoj lateralnih organa4, primijetili smo da su GA signali bili niski u cvjetnom primordiju (P) počevši od faze P3 (Slika 4a, b), dok su mladi P1 i P2 primordiji imali umjerenu aktivnost sličnu onoj u centralnoj regiji (Slika 4a, b). Veća GA signalna aktivnost detektovana je na granicama primordija organa, počevši od P1/P2 (na stranama granice) i dostižući vrhunac na P4, kao i u svim ćelijama periferne regije koja se nalazi između primordija (Slika 4a, b i Dopunska slika 8a, b). Ova veća GA signalna aktivnost uočena je ne samo u epidermi, već i u L2 i gornjim L3 slojevima (Dopunska slika 8b). Obrazac GA signala detektovanih u SAM-u korištenjem qmRGA također je ostao nepromijenjen tokom vremena (Dopunska slika 8c–f, k). Iako je konstrukt qd17mRGA sistematski smanjen u SAM-u T3 biljaka iz pet nezavisnih linija koje smo detaljno okarakterizirali, uspjeli smo analizirati obrasce fluorescencije dobijene konstruktom pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Dopunska slika 8g–j, l). U ovoj kontrolnoj liniji, detektovane su samo manje promjene u omjeru fluorescencije u SAM-u, ali u centru SAM-a smo uočili jasno i neočekivano smanjenje VENUS-a povezanog sa TagBFP. Ovo potvrđuje da obrazac signalizacije koji je uočila qmRGA odražava GA-zavisnu degradaciju mRGA-VENUS, ali također pokazuje da qmRGA može precijeniti GA signalnu aktivnost u centru meristema. Ukratko, naši rezultati otkrivaju obrazac GA signalizacije koji prvenstveno odražava distribuciju primordija. Ova distribucija inter-primordijalne regije (IPR) je posljedica postepenog uspostavljanja visoke GA signalne aktivnosti između primordija u razvoju i centralne regije, dok se istovremeno GA signalna aktivnost u primordiju smanjuje (Slika 4c, d).
Distribucija GID1b i GID1c receptora (vidi gore) sugerira da diferencijalna ekspresija GA receptora pomaže u oblikovanju obrasca aktivnosti GA signala u SAM-u. Pitali smo se da li bi mogla biti uključena diferencijalna akumulacija GA. Da bismo istražili ovu mogućnost, koristili smo nlsGPS1 GA FRET senzor21. Povećana frekvencija aktivacije otkrivena je u SAM-u nlsGPS1 tretiranog sa 10 μM GA4+7 tokom 100 minuta (Dopunska slika 9a-e), što ukazuje da nlsGPS1 reaguje na promjene u koncentraciji GA u SAM-u, kao što to čini u korijenju21. Prostorna distribucija frekvencije aktivacije nlsGPS1 otkrila je relativno niske nivoe GA u vanjskim slojevima SAM-a, ali je pokazala da su povišeni u centru i na granicama SAM-a (Slika 4e i Dopunska slika 9a,c). Ovo sugerira da je GA također distribuiran u SAM-u sa prostornim obrascem uporedivim sa onim koji je otkrio qmRGA. Kao komplementarni pristup, SAM smo također tretirali fluorescentnim GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ili samim Fl kao negativnom kontrolom. Fl signal je bio distribuiran kroz cijeli SAM, uključujući centralnu regiju i primordij, iako nižim intenzitetom (slika 4j i dodatna slika 10d). Nasuprot tome, sva tri GA-Fl su se akumulirala specifično unutar granica primordija i u različitim stupnjevima u ostatku IPR-a, pri čemu se GA7-Fl akumulirao u najvećem domenu u IPR-u (slika 4k i dodatna slika 10a,b). Kvantifikacija intenziteta fluorescencije otkrila je da je omjer intenziteta IPR-a i ne-IPR-a bio veći u SAM-u tretiranom GA-Fl u poređenju sa SAM-om tretiranim Fl-om (slika 4l i dodatna slika 10c). Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da je GA prisutan u većim koncentracijama u IPR ćelijama koje se nalaze najbliže granici organa. To sugerira da obrazac aktivnosti SAM GA signala proizlazi i iz diferencijalne ekspresije GA receptora i diferencijalne akumulacije GA u IPR ćelijama blizu granica organa. Dakle, naša analiza je otkrila neočekivani prostorno-vremenski obrazac GA signalizacije, sa nižom aktivnošću u centru i primordijumu SAM-a i većom aktivnošću u IPR-u u perifernoj regiji.
Da bismo razumjeli ulogu diferencijalne GA signalne aktivnosti u SAM-u, analizirali smo korelaciju između GA signalne aktivnosti, širenja ćelija i diobe ćelija koristeći snimanje u realnom vremenu sa ubrzanim snimkom SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. S obzirom na ulogu GA u regulaciji rasta, očekivala se pozitivna korelacija sa parametrima širenja ćelija. Stoga smo prvo uporedili mape GA signalne aktivnosti sa mapama brzine rasta ćelijske površine (kao zamjenu za snagu širenja ćelija za datu ćeliju i za ćelije kćeri pri diobi) i sa mapama anizotropije rasta, koja mjeri usmjerenost širenja ćelija (također korišteno ovdje za datu ćeliju i za ćelije kćeri pri diobi; Slika 5a,b, vidi Metode i Dopunske metode). Naše mape brzine rasta ćelijske površine SAM-a su u skladu sa prethodnim zapažanjima38,39, sa minimalnim stopama rasta na granici i maksimalnim stopama rasta u razvoju cvjetova (Slika 5a). Analiza glavnih komponenti (PCA) pokazala je da je GA signalna aktivnost negativno korelirana sa intenzitetom rasta ćelijske površine (Slika 5c). Također smo pokazali da su glavne ose varijacije, uključujući ulaz GA signalizacije i intenzitet rasta, ortogonalne na smjer određen visokom ekspresijom CLV3, što potvrđuje isključenje ćelija iz SAM centra u preostalim analizama. Spearmanova korelacijska analiza potvrdila je rezultate PCA (Slika 5d), što ukazuje na to da viši GA signali u IPR-u nisu rezultirali većom ekspanzijom ćelija. Međutim, korelacijska analiza otkrila je blagu pozitivnu korelaciju između aktivnosti GA signalizacije i anizotropije rasta (Slika 5c, d), što sugerira da viša GA signalizacija u IPR-u utiče na smjer rasta ćelija i moguće na položaj ravni ćelijske diobe.
a, b Toplotne mape srednjeg površinskog rasta (a) i anizotropije rasta (b) u SAM-u usrednjene za sedam nezavisnih biljaka (korištene kao zamjene za snagu i smjer širenja ćelija, respektivno). c PCA analiza uključivala je sljedeće varijable: GA signal, intenzitet površinskog rasta, anizotropiju površinskog rasta i ekspresiju CLV3. PCA komponenta 1 bila je uglavnom negativno korelirana s intenzitetom površinskog rasta i pozitivno korelirala s GA signalom. PCA komponenta 2 bila je uglavnom pozitivno korelirana s anizotropijom površinskog rasta i negativno korelirala s ekspresijom CLV3. Postoci predstavljaju varijaciju objašnjenu svakom komponentom. d Spearmanova korelacijska analiza između GA signala, intenziteta površinskog rasta i anizotropije površinskog rasta na tkivnoj skali isključujući CZ. Broj s desne strane je Spearmanova rho vrijednost između dvije varijable. Zvjezdice označavaju slučajeve gdje je korelacija/negativna korelacija vrlo značajna. e 3D vizualizacija Col-0 SAM L1 ćelija konfokalnom mikroskopijom. Novi ćelijski zidovi formirani u SAM-u (ali ne i primordijumu) nakon 10 sati obojeni su prema njihovim vrijednostima ugla. Traka boja je prikazana u donjem desnom uglu. Umetak prikazuje odgovarajuću 3D sliku u 0 h. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. f Okvirni dijagrami prikazuju brzine diobe ćelija u IPR i ne-IPR Col-0 SAM (n = 10 nezavisnih biljaka). Središnja linija prikazuje medijanu, a granice okvira označavaju 25. i 75. percentil. Brkovi označavaju minimalne i maksimalne vrijednosti određene R softverom. P vrijednosti su dobijene Welchovim dvostranim t-testom. g, h Shematski dijagram koji prikazuje (g) kako izmjeriti ugao novog ćelijskog zida (magenta) u odnosu na radijalni smjer od centra SAM-a (bijela isprekidana linija) (uzimaju se u obzir samo vrijednosti oštrog ugla, tj. 0–90°), i (h) obodni/lateralni i radijalni smjerovi unutar meristema. i Histogrami frekvencije orijentacije ravni diobe ćelija preko SAM-a (tamnoplava), IPR (srednje plava) i ne-IPR (svijetloplava), respektivno. P-vrijednosti su dobijene dvostranim Kolmogorov-Smirnov testom. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. j Frekvencijski histogrami orijentacije ravni ćelijske diobe IPR-a oko P3 (svijetlozelena), P4 (srednje zelena) i P5 (tamnozelena), respektivno. P-vrijednosti su dobijene dvostranim Kolmogorov-Smirnov testom. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima.
Stoga smo zatim istražili korelaciju između GA signalizacije i aktivnosti ćelijske diobe identificiranjem novoformiranih ćelijskih zidova tokom testa (Sl. 5e). Ovaj pristup nam je omogućio mjerenje učestalosti i smjera ćelijske diobe. Iznenađujuće, otkrili smo da je učestalost ćelijskih dioba u IPR i ostatku SAM (ne-IPR, Sl. 5f) bila slična, što ukazuje na to da razlike u GA signalizaciji između IPR i ne-IPR ćelija ne utiču značajno na ćelijsku diobu. Ovo, i pozitivna korelacija između GA signalizacije i anizotropije rasta, potaknula nas je da razmotrimo da li aktivnost GA signalizacije može utjecati na orijentaciju ravni ćelijske diobe. Izmjerili smo orijentaciju novog ćelijskog zida kao oštar ugao u odnosu na radijalnu osu koja spaja centar meristema i centar novog ćelijskog zida (Sl. 5e-i) i uočili jasnu tendenciju da se ćelije dijele pod uglovima bliskim 90° u odnosu na radijalnu osu, s najvišim frekvencijama uočenim na 70–80° (23,28%) i 80–90° (22,62%) (Sl. 5e,i), što odgovara ćelijskim diobama u obodnom/poprečnom smjeru (Sl. 5h). Da bismo ispitali doprinos GA signalizacije ovom ponašanju ćelijske diobe, analizirali smo parametre ćelijske diobe u IPR i ne-IPR odvojeno (Sl. 5i). Uočili smo da se raspodjela uglova diobe u IPR ćelijama razlikuje od one u ćelijama koje nisu IPR ili u ćelijama u cijelom SAM-u, pri čemu IPR ćelije pokazuju veći udio lateralnih/kružnih ćelijskih dioba, tj. 70–80° i 80–90° (33,86% i 30,71%, respektivno, odgovarajući omjeri) (Sl. 5i). Dakle, naša zapažanja otkrila su povezanost između visoke GA signalizacije i orijentacije ravni diobe ćelija blizu obodnog smjera, slično korelaciji između aktivnosti GA signalizacije i anizotropije rasta (Sl. 5c, d). Da bismo dalje utvrdili prostornu očuvanost ove povezanosti, izmjerili smo orijentaciju ravni diobe u IPR ćelijama koje okružuju primordij počevši od P3, budući da je najveća aktivnost GA signalizacije detektovana u ovoj regiji počevši od P4 (Sl. 4). Uglovi diobe IPR oko P3 i P4 nisu pokazali statistički značajne razlike, iako je uočena povećana učestalost lateralnih ćelijskih dioba u IPR oko P4 (Sl. 5j). Međutim, u IPR ćelijama oko P5, razlika u orijentaciji ravni ćelijske diobe postala je statistički značajna, sa naglim porastom učestalosti transverzalnih ćelijskih dioba (Sl. 5j). Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da GA signalizacija može kontrolirati orijentaciju ćelijskih dioba u SAM, što je u skladu s prethodnim izvještajima40,41 da visoka GA signalizacija može inducirati lateralnu orijentaciju ćelijskih dioba u IPR.
Predviđa se da ćelije u IPR-u neće biti ugrađene u primordije, već u internodije2,42,43. Transverzalna orijentacija ćelijskih dioba u IPR-u može rezultirati tipičnom organizacijom paralelnih uzdužnih redova epidermalnih ćelija u internodijima. Naša gore opisana zapažanja sugeriraju da GA signalizacija vjerovatno igra ulogu u ovom procesu regulisanjem smjera ćelijske diobe.
Gubitak funkcije nekoliko Excel gena rezultira konstitutivnim GA odgovorom, a della mutanti se mogu koristiti za testiranje ove hipoteze44. Prvo smo analizirali obrasce ekspresije pet Excel gena u SAM-u. Transkripcijska fuzija GUS linije45 otkrila je da su GAI, RGA, RGL1 i RGL2 (u mnogo manjoj mjeri) eksprimirani u SAM-u (Dopunska slika 11a-d). In situ hibridizacija je dalje pokazala da se GAI mRNA akumulira specifično u primordijima i cvjetovima u razvoju (Dopunska slika 11e). RGL1 i RGL3 mRNA su detektovane u cijelom krošnji SAM-a i u starijim cvjetovima, dok je RGL2 mRNA bila obilnija u graničnom području (Dopunska slika 11f-h). Konfokalno snimanje pRGL3::RGL3-GFP SAM potvrdilo je ekspresiju uočenu in situ hibridizacijom i pokazalo da se RGL3 protein akumulira u centralnom dijelu SAM-a (Dopunska slika 11i). Koristeći liniju pRGA::GFP-RGA, također smo otkrili da se RGA protein akumulira u SAM-u, ali njegova zastupljenost se smanjuje na granici počevši od P4 (Dopunska slika 11j). Značajno je da su obrasci ekspresije RGL3 i RGA u skladu s većom aktivnošću GA signalizacije u IPR-u, što je detektirano pomoću qmRGA (Slika 4). Štaviše, ovi podaci ukazuju na to da su svi DNA proteini eksprimirani u SAM-u i da njihova ekspresija kolektivno obuhvata cijeli SAM.
Zatim smo analizirali parametre diobe ćelija kod divljeg tipa SAM-a (Ler, kontrola) i gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globalnih) mutanata (Slika 6a, b). Zanimljivo je da smo uočili statistički značajnu promjenu u distribuciji frekvencija uglova diobe ćelija kod della global mutanta SAM u poređenju sa divljim tipom (Slika 6c). Ova promjena kod della global mutanta bila je posljedica povećanja frekvencije uglova od 80–90° (34,71% u odnosu na 24,55%) i, u manjoj mjeri, uglova od 70–80° (23,78% u odnosu na 20,18%), tj. odgovara poprečnim diobama ćelija (Slika 6c). Učestalost ne-poprečnih dioba (0–60°) također je bila niža kod della global mutanta (Slika 6c). Učestalost poprečnih dioba ćelija bila je značajno povećana kod SAM-a della global mutanta (Slika 6b). Učestalost transverzalnih ćelijskih dioba u IPR regiji bila je također veća kod della global mutanta u poređenju s divljim tipom (Sl. 6d). Izvan IPR regije, divlji tip je imao ujednačeniju raspodjelu uglova ćelijskih dioba, dok je della global mutant preferirao tangencijalne diobe poput IPR regije (Sl. 6e). Također smo kvantificirali orijentaciju ćelijskih dioba u SAM-u petostrukih mutanata ga2 oksidaze (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 i ga2ox6-2), GA-neaktivne mutantne pozadine u kojoj se GA akumulira. U skladu s povećanjem nivoa GA, SAM petostrukog ga2ox mutanta cvasti bio je veći od onog kod Col-0 (Dopunska slika 12a, b), i u poređenju sa Col-0, petostruki ga2ox SAM pokazao je izrazito drugačiju distribuciju uglova ćelijske diobe, s frekvencijom ugla koja se povećavala od 50° do 90°, tj. ponovo favorizirajući tangencijalne diobe (Dopunska slika 12a-c). Dakle, pokazujemo da konstitutivna aktivacija GA signalizacije i akumulacija GA induciraju lateralne ćelijske diobe u IPR i ostatku SAM-a.
a, b 3D vizualizacija L1 sloja PI-obojenog Ler (a) i globalnog della mutanta (b) SAM-a korištenjem konfokalne mikroskopije. Novi ćelijski zidovi formirani u SAM-u (ali ne i u primordijumu) tokom perioda od 10 sati prikazani su i obojeni prema njihovim vrijednostima ugla. Umetak prikazuje SAM u 0 sati. Traka boja prikazana je u donjem desnom uglu. Strelica u (b) pokazuje na primjer poravnatih ćelijskih datoteka u globalnom della mutantu. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. ce poređenje frekvencijske distribucije orijentacija ravni ćelijske diobe u cijelom SAM-u (d), IPR (e) i ne-IPR (f) između Ler i globalnog della. P vrijednosti su dobijene korištenjem dvostranog Kolmogorov-Smirnovljevog testa. f, g 3D vizualizacija konfokalnih slika PI-obojenog SAM-a transgenih biljaka Col-0 (i) i pCUC2::gai-1-VENUS (j). Paneli (a, b) prikazuju nove ćelijske zidove (ali ne i primordije) formirane u SAM-u unutar 10 sati. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. h–j Poređenje frekvencijske distribucije orijentacija ravni ćelijske diobe u cijelom SAM-u (h), IPR (i) i ne-IPR (j) između biljaka Col-0 i pCUC2::gai-1-VENUS. P-vrijednosti su dobijene korištenjem dvostranog Kolmogorov-Smirnovljevog testa.
Zatim smo testirali učinak inhibicije GA signalizacije specifično u IPR-u. U tu svrhu, koristili smo promotor kotiledonske čašice 2 (CUC2) kako bismo pokrenuli ekspresiju dominantno negativnog gai-1 proteina spojenog sa VENUS-om (u liniji pCUC2::gai-1-VENUS). U divljem tipu SAM-a, CUC2 promotor pokreće ekspresiju većine IPR-ova u SAM-u, uključujući granične ćelije, od P4 nadalje, a slična specifična ekspresija je uočena u biljkama pCUC2::gai-1-VENUS (vidi dolje). Distribucija uglova ćelijske diobe preko SAM-a ili IPR-a biljaka pCUC2::gai-1-VENUS nije se značajno razlikovala od one kod divljeg tipa, iako smo neočekivano otkrili da se ćelije bez IPR-a u ovim biljkama dijele većom frekvencijom od 80–90° (Slika 6f–j).
Sugerirano je da smjer diobe ćelija zavisi od geometrije SAM-a, posebno od zateznog napona generiranog zakrivljenošću tkiva46. Stoga smo se pitali da li je oblik SAM-a promijenjen kod biljaka della global mutanta i pCUC2::gai-1-VENUS. Kao što je prethodno objavljeno12, veličina della global mutanta SAM-a bila je veća od veličine divljeg tipa (Dopunska slika 13a, b, d). In situ hibridizacija CLV3 i STM RNA potvrdila je širenje meristema kod della mutanata i dalje pokazala lateralno širenje niše matičnih ćelija (Dopunska slika 13e, f, h, i). Međutim, zakrivljenost SAM-a bila je slična kod oba genotipa (Dopunska slika 13k, m, n, p). Uočili smo slično povećanje veličine kod gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della četverostrukog mutanta bez promjene zakrivljenosti u poređenju s divljim tipom (Dopunska slika 13c, d, g, j, l, o, p). Učestalost orijentacije ćelijske diobe također je bila pogođena kod della quadruple mutanta, ali u manjoj mjeri nego kod della monolitnog mutanta (Dopunska slika 12d-f). Ovaj efekat doze, zajedno s nedostatkom efekta na zakrivljenost, sugerira da rezidualna RGL3 aktivnost kod Della quadruple mutanta ograničava promjene u orijentaciji ćelijske diobe uzrokovane gubitkom Excel aktivnosti i da se promjene u lateralnim ćelijskim diobama javljaju kao odgovor na promjene u GA signalnoj aktivnosti, a ne na promjene u geometriji SAM-a. Kao što je gore opisano, CUC2 promotor pokreće ekspresiju IPR u SAM-u počevši od P4 (Dopunska slika 14a, b), i nasuprot tome, pCUC2::gai-1-VENUS SAM imao je smanjenu veličinu, ali veću zakrivljenost (Dopunska slika 14c-h). Ova promjena u morfologiji pCUC2::gai-1-VENUS SAM može rezultirati drugačijom raspodjelom mehaničkih napona u poređenju s divljim tipom, kod kojeg visoki obodni naponi počinju na kraćoj udaljenosti od centra SAM-a47. Alternativno, promjene u morfologiji pCUC2::gai-1-VENUS SAM mogu biti rezultat promjena u regionalnim mehaničkim svojstvima izazvanih ekspresijom transgena48. U oba slučaja, ovo bi moglo djelimično neutralizirati efekte promjena u GA signalizaciji povećanjem vjerovatnoće da će se ćelije dijeliti u cirkumferencijalnoj/transverzalnoj orijentaciji, što objašnjava naša zapažanja.
Uzeti zajedno, naši podaci potvrđuju da viša GA signalizacija igra aktivnu ulogu u lateralnoj orijentaciji ravni ćelijske diobe u IPR-u. Također pokazuju da zakrivljenost meristema također utiče na orijentaciju ravni ćelijske diobe u IPR-u.
Transverzalna orijentacija ravni diobe u IPR-u, zbog visoke aktivnosti GA signalizacije, sugerira da GA prethodno organizira radijalni ćelijski file u epidermi unutar SAM-a kako bi definirao ćelijsku organizaciju koja će se kasnije naći u epidermalnom internodiju. Zaista, takvi ćelijski fileovi su često bili vidljivi na SAM slikama della global mutanata (Sl. 6b). Stoga, kako bismo dalje istražili razvojnu funkciju prostornog obrasca GA signalizacije u SAM-u, koristili smo snimanje s ubrzanim snimcima (time-lapse) kako bismo analizirali prostornu organizaciju ćelija u IPR-u kod transgenih biljaka divljeg tipa (Ler i Col-0), della global mutanata i pCUC2::gai-1-VENUS.
Otkrili smo da qmRGA pokazuje da se GA signalna aktivnost u IPR povećava od P1/P2 i dostiže vrhunac na P4, te da je ovaj obrazac ostao konstantan tokom vremena (Slika 4a-f i Dopunska slika 8c-f, k). Da bismo analizirali prostornu organizaciju ćelija u IPR sa povećanjem GA signala, označili smo Ler IPR ćelije iznad i sa strane P4 prema njihovoj razvojnoj sudbini analiziranoj 34 sata nakon prvog posmatranja, tj. više od dva plastidna vremena, što nam je omogućilo da pratimo IPR ćelije tokom razvoja primordija od P1/P2 do P4. Koristili smo tri različite boje: žutu za one ćelije koje su bile integrirane u primordij blizu P4, zelenu za one koje su bile u IPR i ljubičastu za one koje su učestvovale u oba procesa (Slika 7a-c). U t0 (0 h), 1-2 sloja IPR ćelija bila su vidljiva ispred P4 (Slika 7a). Kao što se i očekivalo, kada su se ove ćelije dijelile, to su činile uglavnom putem transverzalne ravni diobe (Slike 7a-c). Slični rezultati su dobijeni korištenjem Col-0 SAM (fokusirajući se na P3, čija se granica savija slično kao P4 kod Ler-a), iako je kod ovog genotipa nabor formiran na cvjetnoj granici brže sakrio IPR ćelije (Sl. 7g–i). Dakle, obrazac diobe IPR ćelija prethodno organizuje ćelije u radijalne redove, kao u internodijima. Organizacija radijalnih redova i lokalizacija IPR ćelija između uzastopnih organa sugerišu da su ove ćelije internodalne progenitore.
Ovdje smo razvili raciometrijski GA signalni biosenzor, qmRGA, koji omogućava kvantitativno mapiranje GA signalne aktivnosti koja proizlazi iz kombinovanih koncentracija GA i GA receptora, uz minimiziranje interferencije s endogenim signalnim putevima, čime se pružaju informacije o GA funkciji na ćelijskom nivou. U tu svrhu, konstruisali smo modificirani PELL protein, mRGA, koji je izgubio sposobnost vezivanja za PELL interakcijske partnere, ali ostaje osjetljiv na GA-indukovanu proteolizu. qmRGA reaguje i na egzogene i na endogene promjene u nivoima GA, a njegova dinamička svojstva detekcije omogućavaju procjenu prostorno-vremenskih promjena u GA signalnoj aktivnosti tokom razvoja. qmRGA je također vrlo fleksibilan alat jer se može prilagoditi različitim tkivima promjenom promotora koji se koristi za njegovu ekspresiju (ako je potrebno), a s obzirom na konzerviranu prirodu GA signalnog puta i PFYRE motiva kod angiospermi, vjerovatno je da će se moći prenijeti na druge vrste22. U skladu s tim, pokazano je da ekvivalentna mutacija u rižinom SLR1 PELA proteinu (HYY497AAA) također suzbija aktivnost represora rasta SLR1, dok samo neznatno smanjuje njegovu GA-posredovanu degradaciju, slično mRGA23. Zanimljivo je da su nedavne studije na Arabidopsisu pokazale da je jedna mutacija aminokiseline u PFYRE domenu (S474L) promijenila transkripcijsku aktivnost RGA bez utjecaja na njegovu sposobnost interakcije s partnerskim transkripcijskim faktorima50. Iako je ova mutacija vrlo blizu 3 supstitucije aminokiselina prisutne u mRGA, naše studije pokazuju da ove dvije mutacije mijenjaju različite karakteristike PELA. Iako se većina partnera transkripcijskih faktora veže za LHR1 i SAW domene PELA26,51, neke konzervirane aminokiseline u PFYRE domenu mogu pomoći u stabilizaciji ovih interakcija.
Razvoj internodija je ključna osobina u arhitekturi biljke i poboljšanju prinosa. qmRGA je otkrio veću GA signalnu aktivnost u IPR internodijalnim progenitorskim ćelijama. Kombinacijom kvantitativnog snimanja i genetike, pokazali smo da GA signalni obrasci superponiraju kružne/poprečne ravni ćelijske diobe u epidermi SAM-a, oblikujući organizaciju ćelijske diobe potrebnu za razvoj internodija. Tokom razvoja identifikovano je nekoliko regulatora orijentacije ravni ćelijske diobe52,53. Naš rad pruža jasan primjer kako GA signalna aktivnost reguliše ovaj ćelijski parametar. može interagovati sa kompleksima proteina prefoldinga41, tako da GA signalizacija može regulisati orijentaciju ravni ćelijske diobe direktnim uticajem na orijentaciju kortikalnih mikrotubula40,41,54,55. Neočekivano smo pokazali da u SAM-u korelat veće GA signalne aktivnosti nije izduživanje ili dioba ćelija, već samo anizotropija rasta, što je u skladu sa direktnim uticajem GA na smjer ćelijske diobe u IPR-u. Međutim, ne možemo isključiti da bi ovaj efekat mogao biti i indirektan, na primjer posredovan GA-induciranim omekšavanjem ćelijskog zida56. Promjene u svojstvima ćelijskog zida izazivaju mehanički stres57,58, koji također može utjecati na orijentaciju ravni ćelijske diobe utječući na orijentaciju kortikalnih mikrotubula39,46,59. Kombinirani efekti mehaničkog stresa izazvanog GA i direktne regulacije orijentacije mikrotubula pomoću GA mogu biti uključeni u generiranje specifičnog obrasca orijentacije ćelijske diobe u IPR-u kako bi se definirali internodiji, a potrebna su daljnja istraživanja kako bi se testirala ova ideja. Slično tome, prethodne studije su istakle važnost proteina TCP14 i 15 koji interaguju sa DNA u kontroli formiranja internodija60,61 i ovi faktori mogu posredovati djelovanje GA zajedno sa BREVIPEDICELLUS (BP) i PENNYWISE (PNY), koji regulišu razvoj internodija i za koje je pokazano da utiču na GA signalizaciju2,62. S obzirom na to da Aleksandrijev hormon interaguje sa signalnim putevima brasinosteroida, etilena, jasmonske kiseline i abscisinske kiseline (ABA)63,64 i da ovi hormoni mogu uticati na orijentaciju mikrotubula65, efekti GA na orijentaciju ćelijske diobe mogu biti posredovani i drugim hormonima.
Rane citološke studije pokazale su da su i unutrašnji i vanjski dijelovi Arabidopsis SAM-a potrebni za razvoj internodija2,42. Činjenica da GA aktivno reguliše diobu ćelija u unutrašnjim tkivima12 podržava dvostruku funkciju GA u regulaciji veličine meristema i internodija u SAM-u. Obrazac usmjerene diobe ćelija je također strogo regulisan u unutrašnjem tkivu SAM-a, a ova regulacija je neophodna za rast stabljike52. Bit će zanimljivo ispitati da li GA također igra ulogu u orijentaciji ravni diobe ćelija u unutrašnjoj organizaciji SAM-a, čime se sinhronizuje specifikacija i razvoj internodija unutar SAM-a.
Biljke su uzgajane in vitro u zemlji ili 1x Murashige-Skoog (MS) medijumu (Duchefa) dopunjenom sa 1% saharoze i 1% agara (Sigma) pod standardnim uslovima (16 h svjetla, 22 °C), osim za eksperimente s hipokotilom i rastom korijena u kojima su sadnice uzgajane na vertikalnim pločama pod konstantnim svjetlom i 22 °C. Za eksperimente s nitratima, biljke su uzgajane na modificiranom MS medijumu (bioWORLD biljni medijum) dopunjenom s odgovarajućim nitratom (0 ili 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukcinata, 1% saharoze i 1% A-agara (Sigma) pod uslovima dugog dana.
GID1a cDNA umetnuta u pDONR221 je rekombinirana sa pDONR P4-P1R-pUBQ10 i pDONR P2R-P3-mCherry u pB7m34GW da bi se generirao pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNK umetnuta u pDONR221 je rekombinirana u pB7RWG266 da bi se generirao p35S:IDD2-RFP. Da bi se generirao pGID1b::2xmTQ2-GID1b, fragment od 3,9 kb uzvodno od kodirajuće regije GID1b i fragment od 4,7 kb koji sadrži GID1b cDNA (1,3 kb) i terminator (3,4 kb) prvo su amplificirani korištenjem prajmera u Dodatnoj tabeli 3, a zatim umetnuti u pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) i pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respektivno, i konačno rekombinirani sa pDONR221 2xmTQ268 u ciljni vektor pGreen 012567 korištenjem Gateway kloniranja. Da bi se generirao pCUC2::LSSmOrange, CUC2 promotorska sekvenca (3229 bp uzvodno od ATG), nakon čega slijedi kodirajuća sekvenca velikog Stokes-pomaknutog mOrange (LSSmOrange)69 sa N7 signalom nuklearne lokalizacije i NOS transkripcijskim terminatorom, sastavljeni su u pGreen vektor za ciljanje kanamicina korištenjem Gateway 3-fragment rekombinacijskog sistema (Invitrogen). Biljni binarni vektor uveden je u soj Agrobacterium tumefaciens GV3101 i uveden u listove Nicotiana benthamiana metodom infiltracije Agrobacterium i u Arabidopsis thaliana Col-0 metodom cvjetnog uranjanja. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry i pCLV3::mCherry-NLS qmRGA izolirani su iz F3 i F1 potomstva odgovarajućih križanja, respektivno.
RNK in situ hibridizacija je izvršena na vrhovima izdanaka dužine približno 1 cm72, koji su sakupljeni i odmah fiksirani u FAA rastvoru (3,7% formaldehida, 5% sirćetne kiseline, 50% etanola) prethodno ohlađenom na 4 °C. Nakon 2 × 15 minuta vakuumskog tretmana, fiksativ je promijenjen i uzorci su inkubirani preko noći. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 i RGL3 cDNA i antisense probe za njihove 3'-UTR su sintetizirane korištenjem primera prikazanih u Dodatnoj tabeli 3 kako je opisano od strane Rosiera i saradnika.73 Digoksigeninom obilježene sonde su imunodetektovane korištenjem digoksigenin antitijela (3000-struko razrjeđenje; Roche, kataloški broj: 11 093 274 910), a rezovi su obojeni rastvorom 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfata (BCIP, 250-struko razrjeđenje)/nitroplavog tetrazolijuma (NBT, 200-struko razrjeđenje).
Vrijeme objave: 10. februar 2025.