Rast apikalnog meristema (SAM) je kritičan za arhitekturu stabljike. Biljni hormonigiberelini(GA) igraju ključnu ulogu u koordinaciji rasta biljaka, ali njihova uloga u SAM-u ostaje slabo shvaćena. Ovdje smo razvili raciometrijski biosenzor GA signalizacije tako što smo konstruirali DELLA protein da potisne njegovu esencijalnu regulatornu funkciju u odgovoru GA transkripcije uz očuvanje njegove degradacije nakon prepoznavanja GA. Pokazali smo da ovaj biosenzor zasnovan na degradaciji tačno beleži promene u nivoima GA i ćelijskog sensinga tokom razvoja. Koristili smo ovaj biosenzor za mapiranje GA signalne aktivnosti u SAM-u. Pokazali smo da su visoki GA signali prisutni pretežno u stanicama smještenim između primordija organa, koji su prethodnici internodijskih stanica. Koristeći pristupe za dobijanje i gubitak funkcije, mi dalje pokazujemo da GA reguliše orijentaciju ravni ćelijske deobe, uspostavljajući kanonsku ćelijsku organizaciju internodija, čime se promoviše specifikacija internodija u SAM-u.
Apikalni meristem izdanaka (SAM), smješten na vrhu izbojka, sadrži nišu matičnih stanica čija aktivnost stvara bočne organe i čvorove stabljike na modularan i iterativni način tijekom cijelog života biljke. Svaka od ovih ponavljajućih jedinica, ili biljnih čvorova, uključuje internodije i bočne organe u čvorovima, i aksilarne meristeme u pazušcima lista1. Rast i organizacija biljnih čvorova mijenja se tokom razvoja. Kod Arabidopsis, internodalni rast je potisnut tokom vegetativne faze, a aksilarni meristemi ostaju u mirovanju u pazuhu listova rozete. Prilikom prelaska u cvjetnu fazu, SAM postaje meristem cvasti, stvarajući izdužene internodije i pazušne pupoljke, grančice u pazuhu listova bobica, a kasnije i bezlisne cvjetove2. Iako smo napravili značajan napredak u razumijevanju mehanizama koji kontroliraju pokretanje listova, cvijeća i grana, relativno se malo zna o tome kako nastaju internodije.
Razumijevanje prostorno-vremenske distribucije GA će pomoći da se bolje razumiju funkcije ovih hormona u različitim tkivima iu različitim razvojnim fazama. Vizuelizacija degradacije RGA-GFP fuzije izražene pod dejstvom sopstvenog promotera daje važne informacije o regulaciji ukupnih nivoa GA u korenima15,16. Međutim, ekspresija RGA varira u različitim tkivima17 i reguliše je GA18. Dakle, diferencijalna ekspresija RGA promotora može rezultirati uzorkom fluorescencije uočenim sa RGA-GFP i stoga ova metoda nije kvantitativna. Nedavno je bioaktivni fluorescein (Fl) označen GA19,20 otkrio akumulaciju GA u endokorteksu korijena i regulaciju njegovih ćelijskih nivoa transportom GA. Nedavno je GA FRET senzor nlsGPS1 pokazao da nivoi GA koreliraju sa elongacijom ćelija u korenu, filamentima i tamno izraslim hipokotilima21. Međutim, kao što smo vidjeli, koncentracija GA nije jedini parametar koji kontrolira signalnu aktivnost GA, jer ovisi o složenim procesima sensinga. Ovdje, nadovezujući se na naše razumijevanje DELLA i GA signalnih puteva, izvještavamo o razvoju i karakterizaciji raciometrijskog biosenzora zasnovanog na degradaciji za GA signalizaciju. Da bismo razvili ovaj kvantitativni biosenzor, koristili smo mutantni GA-osjetljivi RGA koji je fuzioniran sa fluorescentnim proteinom i sveprisutno eksprimiran u tkivima, kao i GA-neosjetljivi fluorescentni protein. Pokazali smo da mutantne RGA proteinske fuzije ne ometaju endogenu GA signalizaciju kada su sveprisutno eksprimirane, i da ovaj biosenzor može kvantifikovati signalnu aktivnost koja je rezultat i GA ulaza i obrade GA signala od strane senzorskog aparata sa visokom prostorno-vremenskom rezolucijom. Koristili smo ovaj biosenzor za mapiranje prostorno-vremenske distribucije signalne aktivnosti GA i kvantifikaciju načina na koji GA reguliše ćelijsko ponašanje u SAM epidermisu. Pokazali smo da GA regulira orijentaciju ravni podjele SAM ćelija koje se nalaze između primordija organa, čime se definira kanonska ćelijska organizacija internodija.
Konačno, pitali smo da li qmRGA može izvesti promjene u endogenim nivoima GA koristeći rastuće hipokotile. Ranije smo pokazali da nitrat stimuliše rast povećanjem sinteze GA i, zauzvrat, degradacije DELLA34. U skladu s tim, primijetili smo da je dužina hipokotila u pUBQ10::qmRGA sadnicama uzgojenim uz obilnu opskrbu nitratima (10 mM NO3−) bila značajno duža od one u presadnicama uzgojenim u uvjetima s nedostatkom nitrata (dopunska slika 6a). U skladu s odgovorom na rast, GA signali su bili viši u hipokotilima sadnica uzgojenih u uslovima 10 mM NO3- nego u sadnicama uzgojenim u odsustvu nitrata (dodatna slika 6b, c). Dakle, qmRGA također omogućava praćenje promjena u signalizaciji GA izazvanih endogenim promjenama koncentracije GA.
Da bismo razumjeli da li signalna aktivnost GA koju detektuje qmRGA ovisi o koncentraciji GA i percepciji GA, kao što se i očekivalo na osnovu dizajna senzora, analizirali smo ekspresiju tri GID1 receptora u vegetativnim i reproduktivnim tkivima. Kod sadnica, reporterska linija GID1-GUS pokazala je da su GID1a i c visoko eksprimirani u kotiledonima (sl. 3a–c). Osim toga, sva tri receptora su eksprimirana u listovima, bočnim primordijama korijena, vrhovima korijena (osim kapice korijena GID1b) i vaskularnom sistemu (sl. 3a–c). U SAM cvasti, detektovali smo GUS signale samo za GID1b i 1c (dodatna slika 7a-c). Hibridizacija in situ potvrdila je ove obrasce ekspresije i dalje pokazala da je GID1c bio jednolično izražen na niskim nivoima u SAM-u, dok je GID1b pokazao veću ekspresiju na periferiji SAM-a (dodatna slika 7d-l). Translacijska fuzija pGID1b::2xmTQ2-GID1b također je otkrila stepenovani raspon ekspresije GID1b, od niske ili nikakve ekspresije u centru SAM-a do visoke ekspresije na granicama organa (dodatna slika 7m). Dakle, GID1 receptori nisu ravnomjerno raspoređeni po tkivima i unutar tkiva. U narednim eksperimentima, takođe smo primetili da prekomerna ekspresija GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) povećava osetljivost qmRGA u hipokotilima na spoljnu primenu GA (slika 3d, e). Nasuprot tome, fluorescencija mjerena qd17mRGA u hipokotilu bila je neosjetljiva na tretman GA3 (Slika 3f, g). Za oba testa, sadnice su tretirane visokim koncentracijama GA (100 μM GA3) da bi se procijenilo brzo ponašanje senzora, gdje je sposobnost vezivanja za GID1 receptor bila poboljšana ili izgubljena. Zajedno, ovi rezultati potvrđuju da qmRGA biosenzor služi kombinovanoj funkciji kao GA i GA senzor, i sugerišu da diferencijalna ekspresija GID1 receptora može značajno modulirati emisivnost senzora.
Do danas, distribucija GA signala u SAM-u ostaje nejasna. Zbog toga smo koristili biljke koje eksprimiraju qmRGA i pCLV3::mCherry-NLS reporter matičnih ćelija35 za izračunavanje kvantitativnih mapa visoke rezolucije GA signalne aktivnosti, fokusirajući se na sloj L1 (epidermis; slika 4a, b, vidi Metode i dodatne metode S a ključnu ulogu u kontroli rasta L1), budući da L1 igra ključnu ulogu u kontroli rasta. Ovdje je pCLV3::mCherry-NLS izraz pružio fiksnu geometrijsku referentnu tačku za analizu prostorno-vremenske distribucije GA signalne aktivnosti37. Iako se GA smatra bitnim za razvoj bočnih organa4, uočili smo da su GA signali bili niski u cvjetnom primordijumu (P) počevši od faze P3 (sl. 4a, b), dok su mladi primordijumi P1 i P2 imali umjerenu aktivnost sličnu onoj u središnjoj regiji (slika 4a, b). Veća signalna aktivnost GA otkrivena je na granicama primordija organa, počevši od P1/P2 (na stranama granice) i vrhunac na P4, kao iu svim ćelijama periferne regije smještene između primordija (sl. 4a, b i dopunska slika 8a, b). Ova veća signalna aktivnost GA uočena je ne samo u epidermi već iu L2 i gornjim L3 slojevima (dodatna slika 8b). Obrazac GA signala otkrivenih u SAM-u pomoću qmRGA također je ostao nepromijenjen tokom vremena (dodatna slika 8c-f, k). Iako je konstrukt qd17mRGA sistematski smanjen u SAM biljaka T3 iz pet nezavisnih linija koje smo detaljno okarakterizirali, uspjeli smo analizirati obrasce fluorescencije dobivene s pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP konstruktom (dodatna slika 8g-j, l). U ovoj kontrolnoj liniji detektovane su samo manje promjene u omjeru fluorescencije u SAM-u, ali u SAM centru smo uočili jasno i neočekivano smanjenje VENUS-a povezanog sa TagBFP. Ovo potvrđuje da obrazac signalizacije koji opaža qmRGA odražava degradaciju mRGA-VENUS-a ovisno o GA, ali također pokazuje da qmRGA može precijeniti signalnu aktivnost GA u meristemskom centru. Ukratko, naši rezultati otkrivaju obrazac GA signalizacije koji prvenstveno odražava distribuciju primordija. Ovakva distribucija inter-primordijalnog regiona (IPR) je posledica postepenog uspostavljanja visoke signalne aktivnosti GA između primordija u razvoju i centralnog regiona, dok u isto vreme opada signalna aktivnost GA u primordijumu (sl. 4c, d).
Distribucija GID1b i GID1c receptora (vidi gore) sugerira da diferencijalna ekspresija GA receptora pomaže u oblikovanju obrasca signalne aktivnosti GA u SAM-u. Pitali smo se može li biti uključena diferencijalna akumulacija GA. Da bismo istražili ovu mogućnost, koristili smo nlsGPS1 GA FRET senzor21. Povećana frekvencija aktivacije otkrivena je u SAM-u nlsGPS1 tretiranog sa 10 μM GA4+7 tokom 100 minuta (dopunska slika 9a-e), što ukazuje da nlsGPS1 reaguje na promjene u koncentraciji GA u SAM-u, kao što to čini u korijenima21. Prostorna distribucija frekvencije aktivacije nlsGPS1 otkrila je relativno niske nivoe GA u vanjskim slojevima SAM-a, ali je pokazala da su oni povišeni u centru i na granicama SAM-a (slika 4e i dodatna slika 9a,c). Ovo sugerira da je GA također distribuiran u SAM-u sa prostornim uzorkom koji je uporediv s onim koji je otkrio qmRGA. Kao komplementarni pristup, također smo tretirali SAM sa fluorescentnim GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ili samim Fl kao negativnom kontrolom. Fl signal je bio distribuiran kroz SAM, uključujući centralnu regiju i primordijum, iako nižeg intenziteta (Slika 4j i Dodatna slika 10d). Nasuprot tome, sva tri GA-Fl akumulirala su se specifično unutar granica primordija iu različitom stepenu u ostatku IPR-a, pri čemu se GA7-Fl akumulirao u najvećem domenu u IPR-u (slika 4k i dodatna slika 10a,b). Kvantifikacija intenziteta fluorescencije otkrila je da je odnos intenziteta IPR i non-IPR bio veći u SAM-u tretiranom GA-Fl u poređenju sa SAM-om tretiranim Fl (Slika 4l i Dodatna slika 10c). Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da je GA prisutan u višim koncentracijama u IPR stanicama koje se nalaze najbliže granici organa. Ovo sugerira da je obrazac signalne aktivnosti SAM GA rezultat i diferencijalne ekspresije GA receptora i diferencijalne akumulacije GA u IPR ćelijama blizu granica organa. Stoga je naša analiza otkrila neočekivani prostorno-vremenski obrazac GA signalizacije, sa nižom aktivnošću u centru i primordiju SAM-a i većom aktivnošću u IPR-u u perifernoj regiji.
Da bismo razumjeli ulogu diferencijalne signalne aktivnosti GA u SAM-u, analizirali smo korelaciju između signalne aktivnosti GA, proširenja ćelije i diobe ćelije koristeći snimanje u realnom vremenu s time-lapse SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. S obzirom na ulogu GA u regulaciji rasta, očekivala se pozitivna korelacija sa parametrima ćelijske ekspanzije. Stoga smo najprije uporedili karte GA signalne aktivnosti s mapama brzine rasta ćelijske površine (kao zamjenu za jačinu ćelijske ekspanzije za datu ćeliju i za ćelije kćeri pri diobi) i sa mapama anizotropije rasta, koje mjere usmjerenost ćelijske ekspanzije (koja se ovdje koristi i za datu ćeliju i za ćelije kćeri pri diobi; Dodatak, vidi metodu 5b, metodu b). Naše mape brzine rasta površine SAM ćelija su u skladu sa prethodnim zapažanjima38,39, sa minimalnim stopama rasta na granici i maksimalnim stopama rasta u cvetovima u razvoju (Sl. 5a). Analiza glavnih komponenti (PCA) je pokazala da je aktivnost signalizacije GA u negativnoj korelaciji sa intenzitetom rasta površine ćelije (Slika 5c). Također smo pokazali da su glavne ose varijacije, uključujući ulaz signala GA i intenzitet rasta, bile ortogonalne u odnosu na smjer određen visokom ekspresijom CLV3, potvrđujući isključenje ćelija iz SAM centra u preostalim analizama. Spearmanova korelacijska analiza potvrdila je rezultate PCA (Slika 5d), što ukazuje da viši GA signali u IPR-u nisu rezultirali većom ekspanzijom ćelije. Međutim, korelaciona analiza je otkrila blagu pozitivnu korelaciju između signalne aktivnosti GA i anizotropije rasta (slika 5c, d), što sugerira da veća signalizacija GA u IPR-u utiče na smjer rasta ćelije i moguće na položaj ravni stanične diobe.
a, b Toplotne mape srednjeg površinskog rasta (a) i anizotropije rasta (b) u SAM u prosjeku za sedam nezavisnih biljaka (koriste se kao zamjenske vrijednosti za snagu i smjer širenja ćelije, respektivno). c PCA analiza je uključivala sljedeće varijable: GA signal, površinski intenzitet rasta, anizotropiju rasta površine i ekspresiju CLV3. PCA komponenta 1 uglavnom je bila u negativnoj korelaciji sa intenzitetom površinskog rasta i u pozitivnoj korelaciji sa GA signalom. PCA komponenta 2 je uglavnom bila u pozitivnoj korelaciji sa anizotropijom rasta površine i negativno sa ekspresijom CLV3. Procenti predstavljaju varijaciju objašnjenu svakom komponentom. d Spearmanova analiza korelacije između GA signala, površinskog intenziteta rasta i anizotropije površinskog rasta na skali tkiva isključujući CZ. Broj na desnoj strani je Spearmanova rho vrijednost između dvije varijable. Zvezdice označavaju slučajeve u kojima je korelacija/negativna korelacija veoma značajna. e 3D vizualizacija Col-0 SAM L1 ćelija konfokalnom mikroskopijom. Novi ćelijski zidovi formirani u SAM-u (ali ne i primordiju) nakon 10 h su obojeni u skladu sa svojim vrijednostima uglova. Traka boja je prikazana u donjem desnom uglu. Umetak prikazuje odgovarajuću 3D sliku na 0 h. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. f Okvirni grafikoni prikazuju stope diobe ćelija u IPR i non-IPR Col-0 SAM (n = 10 nezavisnih biljaka). Središnja linija pokazuje medijanu, a granice okvira označavaju 25. i 75. percentil. Brkovi označavaju minimalne i maksimalne vrijednosti određene pomoću R softvera. P vrijednosti su dobijene Welchovim dvostranim t-testom. g, h Šematski dijagram koji pokazuje (g) kako izmjeriti ugao novog ćelijskog zida (magenta) u odnosu na radijalni smjer od centra SAM-a (bijela tačkasta linija) (razmotrene su samo vrijednosti akutnog ugla, tj. 0-90°), i (h) obodni/lateralni i radijalni smjerovi. i Frekvencijski histogrami orijentacije ravni ćelijske diobe preko SAM-a (tamno plava), IPR (srednje plava) i ne-IPR (svjetloplava), respektivno. P vrijednosti su dobijene dvostranim Kolmogorov-Smirnov testom. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. j Frekvencijski histogrami orijentacije IPR ravni podjele ćelija oko P3 (svijetlo zelena), P4 (srednje zelena) i P5 (tamno zelena), respektivno. P vrijednosti su dobijene dvostranim Kolmogorov-Smirnov testom. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima.
Stoga smo zatim istražili korelaciju između GA signalizacije i aktivnosti ćelijske diobe identifikacijom novoformiranih ćelijskih zidova tokom testa (slika 5e). Ovaj pristup nam je omogućio mjerenje učestalosti i smjera diobe stanica. Iznenađujuće, otkrili smo da je učestalost dioba ćelija u IPR i ostatku SAM-a (ne-IPR, slika 5f) slična, što ukazuje da razlike u GA signalizaciji između IPR i non-IPR ćelija ne utiču značajno na diobu ćelija. Ovo, kao i pozitivna korelacija između GA signalizacije i anizotropije rasta, potaknuli su nas da razmotrimo može li aktivnost GA signalizacije utjecati na orijentaciju ravni stanične diobe. Izmjerili smo orijentaciju novog ćelijskog zida kao akutni ugao u odnosu na radijalnu osu koja povezuje centar meristema i centar novog ćelijskog zida (slika 5e-i) i uočili jasnu tendenciju da se ćelije dijele pod uglovima blizu 90° u odnosu na radijalnu os, s najvišim frekvencijama uočenim na 70-20° (3). 80–90° (22,62%) (slika 5e,i), što odgovara ćelijskim deobama u obodnom/poprečnom pravcu (slika 5h). Da bismo ispitali doprinos GA signalizacije ovom ponašanju ćelijske diobe, analizirali smo parametre ćelijske diobe u IPR i non-IPR odvojeno (slika 5i). Primijetili smo da se distribucija kuta diobe u IPR ćelijama razlikovala od one u ćelijama koje nisu IPR ili u ćelijama u cijelom SAM-u, pri čemu IPR ćelije pokazuju veći udio bočnih/kružnih ćelijskih dioba, tj. 70–80° i 80–90° (33,86% i 30,71%, proporcionalno,5). Stoga su naša zapažanja otkrila povezanost između visoke GA signalizacije i orijentacije ravni stanične diobe blizu obodnog smjera, slično korelaciji između signalne aktivnosti GA i anizotropije rasta (slika 5c, d). Da bismo dalje utvrdili prostornu konzervaciju ove asocijacije, izmjerili smo orijentaciju ravni podjele u IPR ćelijama koje okružuju primordij počevši od P3, budući da je najveća GA signalna aktivnost otkrivena u ovoj regiji počevši od P4 (slika 4). Uglovi diobe IPR-a oko P3 i P4 nisu pokazali statistički značajne razlike, iako je uočena povećana učestalost bočnih dioba ćelija u IPR-u oko P4 (Sl. 5j). Međutim, u IPR ćelijama oko P5, razlika u orijentaciji ravni ćelijske deobe postala je statistički značajna, sa naglim povećanjem učestalosti poprečnih deoba ćelija (slika 5j). Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da GA signalizacija može kontrolirati orijentaciju ćelijskih dioba u SAM-u, što je u skladu s prethodnim izvještajima40,41 da visoka GA signalizacija može inducirati lateralnu orijentaciju ćelijskih dioba u IPR-u.
Predviđeno je da ćelije u IPR-u neće biti ugrađene u primordija, već u internode2,42,43. Poprečna orijentacija staničnih dioba u IPR-u može rezultirati tipičnom organizacijom paralelnih uzdužnih redova epidermalnih stanica u internodijama. Naša gore opisana zapažanja sugeriraju da GA signalizacija vjerovatno igra ulogu u ovom procesu regulacijom smjera diobe stanica.
Gubitak funkcije nekoliko DELLA gena rezultira konstitutivnim GA odgovorom, a della mutanti se mogu koristiti za testiranje ove hipoteze44. Prvo smo analizirali obrasce ekspresije pet DELLA gena u SAM-u. Transkripcijska fuzija GUS linije45 otkrila je da su GAI, RGA, RGL1 i RGL2 (u mnogo manjoj mjeri) izraženi u SAM-u (dodatna slika 11a-d). In situ hibridizacija je dalje pokazala da se GAI mRNA akumulira posebno u primordijama i cvjetovima u razvoju (dodatna slika 11e). RGL1 i RGL3 mRNA su otkrivene u cijeloj SAM krošnji iu starijim cvjetovima, dok je RGL2 mRNA bila zastupljenija u graničnom području (dopunska slika 11f-h). Konfokalno snimanje pRGL3::RGL3-GFP SAM potvrdilo je ekspresiju uočenu hibridizacijom in situ i pokazalo da se RGL3 protein akumulira u centralnom dijelu SAM-a (dopunska slika 11i). Koristeći liniju pRGA::GFP-RGA, također smo otkrili da se RGA protein akumulira u SAM-u, ali se njegova brojnost smanjuje na granici počevši od P4 (dopunska slika 11j). Značajno je da su obrasci ekspresije RGL3 i RGA konzistentni sa višom signalnom aktivnošću GA u IPR, što je otkriveno pomoću qmRGA (slika 4). Štaviše, ovi podaci ukazuju na to da su svi DELLA-ovi izraženi u SAM-u i da njihov izraz zajedno obuhvata cijeli SAM.
Zatim smo analizirali parametre ćelijske diobe kod SAM divljeg tipa (Ler, kontrola) i gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della petostrukih (globalnih) mutanata (Slika 6a, b). Zanimljivo je da smo uočili statistički značajan pomak u distribuciji frekvencija ugla podjele ćelija u della globalnom mutantnom SAM-u u poređenju sa divljim tipom (slika 6c). Ova promjena u della globalnom mutantu je nastala zbog povećanja učestalosti uglova od 80–90° (34,71% naspram 24,55%) i, u manjoj mjeri, uglova od 70–80° (23,78% naspram 20,18%), tj. što odgovara poprečnim diobama ćelija6c). Učestalost netransverzalnih podjela (0-60°) također je bila niža kod della globalnog mutanta (slika 6c). Učestalost transverzalnih dioba ćelija je značajno povećana u SAM della globalnog mutanta (slika 6b). Učestalost transverzalnih dioba ćelija u IPR-u je takođe bila veća kod della globalnog mutanta u odnosu na divlji tip (slika 6d). Izvan IPR regiona, divlji tip je imao ujednačeniju distribuciju uglova ćelijske deobe, dok je della globalni mutant preferirao tangencijalne podele poput IPR (Slika 6e). Također smo kvantificirali orijentaciju ćelijskih dioba u SAM-u peterostrukih mutanata ga2 oksidaze (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 i ga2ox6-2), GA-neaktivne mutantne pozadine u kojoj se akumulira GA. U skladu s povećanjem nivoa GA, SAM peterostrukog ga2ox mutantnog cvasti bio je veći od Col-0 (dopunska slika 12a, b), a u poređenju sa Col-0, peterostruki ga2ox SAM pokazao je izrazito drugačiju distribuciju uglova ćelijske diobe, s povećanjem frekvencije od 5° i ponovo od 5° i9°. tangencijalne podjele (dopunska slika 12a–c). Dakle, pokazujemo da konstitutivna aktivacija GA signalizacije i akumulacija GA izazivaju bočne diobe ćelija u IPR-u i ostatku SAM-a.
a, b 3D vizualizacija L1 sloja PI obojenog Ler (a) i globalnog della mutanta (b) SAM pomoću konfokalne mikroskopije. Novi ćelijski zidovi formirani u SAM-u (ali ne i primordiju) tokom perioda od 10 sati prikazani su i obojeni u skladu sa njihovim vrijednostima uglova. Umetak prikazuje SAM u 0 h. Traka boja je prikazana u donjem desnom uglu. Strelica u (b) pokazuje na primjer poravnatih datoteka ćelija u globalnom della mutantu. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. Ce poređenje frekvencijske distribucije orijentacija ravnine ćelijske podjele u cijelom SAM-u (d), IPR (e) i ne-IPR (f) između Ler-a i globalnog dela. P vrijednosti su dobijene pomoću dvostranog Kolmogorov-Smirnov testa. f, g 3D vizualizacija konfokalnih slika PI obojenih SAM transgenih biljaka Col-0 (i) i pCUC2::gai-1-VENUS (j). Paneli (a, b) prikazuju nove ćelijske zidove (ali ne i primordija) formirane u SAM-u u roku od 10 h. Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. h–j Poređenje frekvencijske distribucije orijentacija ravni podjele ćelija koje se nalaze u cijeloj SAM (h), IPR (i) i non-IPR (j) između biljaka Col-0 i pCUC2::gai-1-VENUS. P vrijednosti su dobijene pomoću dvostranog Kolmogorov-Smirnov testa.
Zatim smo testirali efekat inhibicije GA signalizacije posebno u IPR. U tu svrhu, koristili smo promotor čašice kotiledona 2 (CUC2) da pokrenemo ekspresiju dominantnog negativnog proteina gai-1 spojenog na VENUS (u pCUC2::gai-1-VENUS liniji). U SAM-u divljeg tipa, CUC2 promotor pokreće ekspresiju većine IPR-ova u SAM-u, uključujući granične ćelije, od P4 nadalje, a slična specifična ekspresija je uočena u pCUC2::gai-1-VENUS biljkama (vidi dolje). Raspodjela uglova ćelijske diobe preko SAM-a ili IPR biljaka pCUC2::gai-1-VENUS nije se značajno razlikovala od one kod divljeg tipa, iako smo neočekivano otkrili da se ćelije bez IPR-a u ovim biljkama dijele na višoj frekvenciji od 80-90° (Slika 6f-j).
Sugerirano je da smjer diobe stanica ovisi o geometriji SAM-a, posebno o vlačnom naprezanju uzrokovanom zakrivljenošću tkiva46. Stoga smo pitali da li je oblik SAM-a promijenjen u della globalnom mutantu i pCUC2::gai-1-VENUS biljkama. Kao što je ranije objavljeno12, veličina della globalnog mutantnog SAM-a bila je veća od veličine divljeg tipa (dopunska slika 13a, b, d). In situ hibridizacija CLV3 i STM RNA potvrdila je ekspanziju meristema u della mutantima i dalje pokazala bočnu ekspanziju niše matičnih ćelija (dodatna slika 13e, f, h, i). Međutim, SAM zakrivljenost je bila slična u oba genotipa (dodatna slika 13k, m, n, p). Primijetili smo sličan porast veličine kod gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della četverostrukog mutanta bez promjene zakrivljenosti u usporedbi s divljim tipom (dodatna slika 13c, d, g, j, l, o, p). Učestalost orijentacije ćelijske diobe također je utjecala na della quadruple mutant, ali u manjoj mjeri nego kod della monolitnog mutanta (dodatna slika 12d-f). Ovaj efekat doze, zajedno sa odsustvom efekta na zakrivljenost, sugeriše da rezidualna aktivnost RGL3 u Della četvorostrukom mutantu ograničava promene u orijentaciji deobe ćelija uzrokovane gubitkom DELLA aktivnosti i da se promene u bočnim deobama ćelija javljaju kao odgovor na promene u GA signalnoj aktivnosti, a ne na promene u geometriji SAM. Kao što je gore opisano, CUC2 promotor pokreće ekspresiju IPR u SAM-u počevši od P4 (dodatna slika 14a, b), a za razliku od toga, pCUC2::gai-1-VENUS SAM je imao smanjenu veličinu, ali veću zakrivljenost (dodatna slika 14c-h). Ova promjena u pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiji može rezultirati drugačijom distribucijom mehaničkih naprezanja u poređenju sa divljim tipom, u kojem visoki obodni naponi počinju na kraćoj udaljenosti od SAM centra47. Alternativno, promjene u pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiji mogu biti rezultat promjena regionalnih mehaničkih svojstava izazvanih ekspresijom transgena48. U oba slučaja, ovo bi moglo djelomično nadoknaditi efekte promjena u GA signalizaciji povećanjem vjerovatnoće da će se ćelije podijeliti u obodnoj/poprečnoj orijentaciji, objašnjavajući naša zapažanja.
Uzeti zajedno, naši podaci potvrđuju da viša GA signalizacija igra aktivnu ulogu u lateralnoj orijentaciji ravni stanične diobe u IPR. Oni takođe pokazuju da zakrivljenost meristema takođe utiče na orijentaciju ravni ćelijske deobe u IPR.
Poprečna orijentacija ravni podjele u IPR-u, zbog visoke GA signalne aktivnosti, sugerira da GA unaprijed organizira radijalnu ćelijsku datoteku u epidermisu unutar SAM-a kako bi definirao ćelijsku organizaciju koja će se kasnije naći u epidermalnoj internodiji. Zaista, takvi fajlovi ćelija su često bili vidljivi na SAM slikama dela globalnih mutanata (slika 6b). Stoga, da bismo dalje istražili razvojnu funkciju prostornog obrasca GA signalizacije u SAM-u, koristili smo time-lapse snimanje da analiziramo prostornu organizaciju ćelija u IPR-u u divljim tipovima (Ler i Col-0), della globalnim mutantima i pCUC2::gai-1-VENUS transgenim biljkama.
Otkrili smo da je qmRGA pokazao da se GA signalna aktivnost u IPR povećala sa P1/P2 i dostigla vrhunac na P4, a ovaj obrazac je ostao konstantan tokom vremena (sl. 4a–f i dodatna slika 8c–f, k). Da bismo analizirali prostornu organizaciju ćelija u IPR sa povećanjem GA signala, označili smo Ler IPR ćelije iznad i sa strane P4 prema njihovoj razvojnoj sudbini analiziranoj 34 h nakon prvog posmatranja, odnosno više od dva vremena plastida, što nam omogućava da pratimo IPR ćelije tokom razvoja primordija od P1/P2 do P4. Koristili smo tri različite boje: žutu za one ćelije koje su bile integrisane u primordijum blizu P4, zelenu za one koje su bile u IPR i ljubičastu za one koje su učestvovale u oba procesa (sl. 7a–c). U t0 (0 h), 1-2 sloja IPR ćelija bila su vidljiva ispred P4 (slika 7a). Kao što se i očekivalo, kada su se ove ćelije dijelile, to su činile uglavnom preko poprečne ravni podjele (slike 7a–c). Slični rezultati su dobijeni korišćenjem Col-0 SAM (fokusiranje na P3, čija se granica savija slično kao P4 kod Ler), iako je kod ovog genotipa nabor formiran na cvetnoj granici brže sakrio IPR ćelije (Sl. 7g–i). Dakle, obrazac podjele IPR ćelija unaprijed organizira ćelije u radijalne redove, kao u internodijama. Organizacija radijalnih redova i lokalizacija IPR ćelija između uzastopnih organa sugerišu da su ove ćelije internodalni progenitori.
Ovdje smo razvili omjerometrijski signalni biosenzor GA, qmRGA, koji omogućava kvantitativno mapiranje GA signalne aktivnosti koja je rezultat kombinovanih koncentracija GA i GA receptora dok minimizira smetnje sa endogenim signalnim putevima, čime se pružaju informacije o funkciji GA na ćelijskom nivou. U tu svrhu, konstruisali smo modifikovani DELLA protein, mRGA, koji je izgubio sposobnost da veže DELLA interakcijske partnere, ali ostaje osetljiv na GA-indukovanu proteolizu. qmRGA reaguje i na egzogene i na endogene promene nivoa GA, a njegova dinamička sensing svojstva omogućavaju procenu prostorno-vremenskih promena u signalnoj aktivnosti GA tokom razvoja. qmRGA je također vrlo fleksibilan alat jer se može prilagoditi različitim tkivima promjenom promotora koji se koristi za njegovu ekspresiju (ako je potrebno), a s obzirom na očuvanu prirodu signalnog puta GA i PFYRE motiva preko kritosjemenjača, vjerojatno će se prenositi na druge vrste22. U skladu s tim, pokazalo se da ekvivalentna mutacija u SLR1 DELLA proteinu riže (HYY497AAA) potiskuje aktivnost represora rasta SLR1 dok samo neznatno smanjuje njegovu degradaciju posredovanu GA, slično mRGA23. Značajno je da su nedavne studije na Arabidopsisu pokazale da je jedna mutacija aminokiseline u domeni PFYRE (S474L) promijenila transkripcijsku aktivnost RGA bez utjecaja na njegovu sposobnost interakcije s partnerima transkripcionog faktora50. Iako je ova mutacija vrlo bliska zamjenama od 3 aminokiseline prisutne u mRGA, naše studije pokazuju da ove dvije mutacije mijenjaju različite karakteristike DELLA. Iako se većina partnera transkripcionog faktora vezuje za LHR1 i SAW domene DELLA26,51, neke konzervirane aminokiseline u domeni PFYRE mogu pomoći u stabilizaciji ovih interakcija.
Razvoj internodija je ključna osobina u arhitekturi biljaka i poboljšanju prinosa. qmRGA je otkrila veću signalnu aktivnost GA u IPR internodnim progenitor ćelijama. Kombinacijom kvantitativnog snimanja i genetike, pokazali smo da GA signalizacijski obrasci superponiraju kružne/poprečne ravni stanične diobe u SAM epidermisu, oblikujući organizaciju diobe stanica potrebnu za razvoj internodija. Tokom razvoja identifikovano je nekoliko regulatora orijentacije u ravni deobe ćelija52,53. Naš rad pruža jasan primjer kako GA signalna aktivnost reguliše ovaj ćelijski parametar. DELLA može da stupi u interakciju sa kompleksima proteina koji se pre savijanja41, tako da GA signalizacija može regulisati orijentaciju ravni deobe ćelije direktnim uticajem na orijentaciju kortikalnih mikrotubula40,41,54,55. Neočekivano smo pokazali da u SAM-u korelat veće signalne aktivnosti GA nije izduženje ili dioba ćelije, već samo anizotropija rasta, što je u skladu s direktnim učinkom GA na smjer diobe stanica u IPR. Međutim, ne možemo isključiti da bi ovaj efekat mogao biti i indirektan, na primjer posredovan omekšavanjem ćelijskog zida izazvanog GA56. Promene u svojstvima ćelijskog zida izazivaju mehanički stres57,58, koji takođe može uticati na orijentaciju ravni ćelijske deobe utičući na orijentaciju kortikalnih mikrotubula39,46,59. Kombinovani efekti mehaničkog stresa izazvanog GA i direktne regulacije orijentacije mikrotubula od strane GA mogu biti uključeni u generisanje specifičnog obrasca orijentacije ćelijske deobe u IPR-u da bi se definisale internode, a potrebne su dalje studije da bi se testirala ova ideja. Slično tome, prethodne studije su naglasile važnost proteina TCP14 i 15 koji djeluju u interakciji DELLA u kontroli formiranja internoda60,61 i ovi faktori mogu posredovati u djelovanju GA zajedno s BREVIPEDICELLUS (BP) i PENNYWISE (PNY), koji regulišu razvoj internodija i pokazalo se da signali2 utiču na 62 GA signal. S obzirom da DELLA reaguju sa signalnim putevima brasinosteroida, etilena, jasmonske kiseline i apscizinske kiseline (ABA)63,64 i da ovi hormoni mogu uticati na orijentaciju mikrotubula65, efekti GA na orijentaciju ćelijske deobe mogu takođe biti posredovani drugim hormonima.
Rane citološke studije su pokazale da su za razvoj internodija potrebni i unutrašnji i vanjski dijelovi Arabidopsis SAM2,42. Činjenica da GA aktivno regulira diobu stanica u unutrašnjim tkivima12 podržava dvostruku funkciju GA u reguliranju veličine meristema i internodije u SAM-u. Obrazac usmjerene diobe stanica je također strogo reguliran u unutrašnjem SAM tkivu, a ova regulacija je neophodna za rast stabljike52. Biće zanimljivo ispitati da li GA takođe igra ulogu u orijentaciji ravni ćelijske podele u unutrašnjoj SAM organizaciji, čime se sinhronizuje specifikacija i razvoj internodija unutar SAM-a.
Biljke su uzgajane in vitro u tlu ili 1x Murashige-Skoog (MS) mediju (Duchefa) sa dodatkom 1% saharoze i 1% agara (Sigma) u standardnim uvjetima (16 h svjetlosti, 22 °C), osim eksperimenata rasta hipokotila i korijena u kojima su sadnice uzgajane na konstantnoj svjetlosti i vertikalnim pločama 22°C. Za eksperimente s nitratima, biljke su uzgajane na modificiranom MS mediju (biljna podloga bioWORLD) sa dodatkom adekvatnih nitrata (0 ili 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukcinata, 1% saharoze i 1% A-agara (Sigma) u uvjetima dugog dana.
GID1a cDNK umetnuta u pDONR221 rekombinovana je sa pDONR P4-P1R-pUBQ10 i pDONR P2R-P3-mCherry u pB7m34GW da bi se stvorio pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNK umetnuta u pDONR221 rekombinovana je u pB7RWG266 da bi se stvorio p35S:IDD2-RFP. Za generiranje pGID1b::2xmTQ2-GID1b, fragment od 3,9 kb uzvodno od kodirajućeg regiona GID1b i fragment od 4,7 kb koji sadrži GID1b cDNK (1,3 kb) i terminator (3,4 kb) prvo su amplificirani korištenjem prajmera u dodatnoj tabeli 3, a zatim su umetnuti prajmeri u p FiDONR-P FiDONR (P FiDONR). Scientific) i pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respektivno, i konačno rekombinovan sa pDONR221 2xmTQ268 u pGreen 012567 ciljni vektor korišćenjem Gateway kloniranja. Za generiranje pCUC2::LSSmOrange, CUC2 promotorska sekvenca (3229 bp uzvodno od ATG) praćena kodirajućom sekvencom velikog Stokesovog pomaknutog mOrange (LSSmOrange)69 sa signalom nuklearne lokalizacije N7 i NOS transkripcijskim terminatorom sastavljeni su u vektor pGreen pomoću kanamicinskog ciljanog sistema za re-Gabin com. (Invitrogen). Biljni binarni vektor je uveden u Agrobacterium tumefaciens soj GV3101 i unesen u listove Nicotiana benthamiana metodom infiltracije Agrobacterium i Arabidopsis thaliana Col-0 metodom floralnog umakanja, respektivno. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry i pCLV3::mCherry-NLS qmRGA su izolovani iz F3 i F1 potomstva odgovarajućih ukrštanja.
RNA in situ hibridizacija je izvedena na oko 1 cm dugim vrhovima izdanaka72, koji su sakupljeni i odmah fiksirani u FAA rastvoru (3,7% formaldehida, 5% sirćetne kiseline, 50% etanola) prethodno ohlađenom na 4 °C. Nakon 2 × 15 min tretmana vakuumom, fiksator je promijenjen i uzorci su inkubirani preko noći. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 i RGL3 cDNK i antisens sonde za njihove 3′-UTR su sintetizovane korišćenjem prajmera prikazanih u Dodatnoj tabeli 3 kako su opisali Rosier et al.73. Sonde označene digoksigeninom su imunodetektovane korištenjem antitijela na digoksigenin (3000-struko razrjeđenje; Roche, kataloški broj: 11 093 274 910), a presjeci su obojeni 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfatom/BCIP, dilu2trozol-50 puta. (NBT, 200-struko razrjeđenje).
Vrijeme objave: Feb-10-2025