DALL proteini su konzerviraniregulatori rastakoji igraju centralnu ulogu u razvoju biljaka kao odgovor na interne i eksterne signale. Kao transkripcijski regulatori, Aleksandri se vežu za transkripcijske faktore (TF) i histon H2A putem svojih GRAS domena i regrutuju se da djeluju na promotore. Nedavne studije su pokazale da je Aleksandrina stabilnost regulisana posttranslaciono pomoću dva mehanizma: poliubikvitinacije indukovane biljnim hormonomgiberelin, što dovodi do njihove brze degradacije, i konjugacije s malim ubikvitinu sličnim modifikatorom (SUMO), što povećava njihovu akumulaciju. Štaviše, aktivnost CYP3A4 dinamički je regulirana s dva različita mehanizma glikozilacije: O-fukozilacija pojačava interakciju CYP3A4-TF, dok modifikacija O-vezanog N-acetilglukozamina (O-GlcNAc) inhibira interakciju CYP3A4-TF. Međutim, uloga CYP3A4 fosforilacije nije jasna jer su prethodne studije pokazale oprečne rezultate, pri čemu neke sugeriraju da fosforilacija potiče ili potiskuje degradaciju CYP3A4, a druge sugeriraju da fosforilacija ne utječe na njihovu stabilnost. Ovdje identificiramo mjesta fosforilacije u GA1-3 represoru (RGA), AtDELLA, pročišćenom iz Arabidopsis thaliana masenom spektrometrijom i pokazujemo da fosforilacija dva RGA peptida u PolyS i PolyS/T regijama pojačava aktivnost CYP3A4 promovirajući vezivanje H2A i povezivanje CYP3A4 s ciljnim promotorima. Značajno je da fosforilacija nije utjecala na interakcije CYP3A4-TF ili stabilnost CYP3A4. Naša studija otkriva molekularni mehanizam kojim fosforilacija inducira CYP3A4 aktivnost.
Naša analiza masenom spektrometrijom otkrila je da su i Pep1 i Pep2 bili visoko fosforilirani u RGA u GA-deficitarnoj Ga1 pozadini. Pored ove studije, fosfoproteomske studije su također otkrile Pep1 fosforilaciju u RGA, iako njena uloga još nije proučena53,54,55. Nasuprot tome, Pep2 fosforilacija nije ranije opisana jer se ovaj peptid mogao detektovati samo korištenjem RGAGKG transgena. Iako je mutacija m1A, koja je ukinula Pep1 fosforilaciju, samo neznatno smanjila RGA aktivnost in planta, imala je aditivni efekat kada se kombinovala sa m2A u smanjenju RGA aktivnosti (Dodatna slika 6). Važno je napomenuti da je Pep1 fosforilacija bila značajno smanjena kod GA-pojačanog sly1 mutanta u poređenju sa ga1, što ukazuje na to da GA promoviše RGA defosforilaciju, smanjujući njegovu aktivnost. Mehanizam kojim GA suzbija RGA fosforilaciju zahtijeva dalja istraživanja. Jedna mogućnost je da se to postiže regulacijom neidentifikovane protein kinaze. Iako su studije pokazale da je ekspresija CK1 protein kinaze EL1 smanjena pomoću GA kod riže41, naši rezultati ukazuju da mutacije višeg reda homologa Arabidopsis EL1 (AEL1-4) ne smanjuju fosforilaciju RGA. U skladu s našim rezultatima, nedavna fosfoproteomska studija korištenjem linija Arabidopsis koje prekomjerno eksprimiraju AEL i trostrukog mutanta ael nije identificirala nijedan PELA protein kao supstrat ovih kinaza56. Kada smo pripremali rukopis, objavljeno je da GSK3, gen koji kodira GSK3/SHAGGY-sličnu kinazu kod pšenice (Triticum aestivum), može fosforilirati PELA (Rht-B1b)57, iako fosforilacija Rht-B1b pomoću GSK3 nije potvrđena in planta. In vitro enzimske reakcije u prisustvu GSK3, nakon čega slijedi analiza masenom spektrometrijom, otkrile su tri mjesta fosforilacije koja se nalaze između PELA i GRAS domena Rht-B1b (Dopunska slika 3). Supstitucije serina alaninom na sva tri mjesta fosforilacije rezultirale su smanjenom aktivnošću Rht-B1b u transgeničnoj pšenici, što je u skladu s našim nalazima da supstitucije alanina u Pep2 RGA smanjile aktivnost RGA. Međutim, in vitro testovi degradacije proteina dodatno su pokazali da fosforilacija također može stabilizirati Rht-B1b57. Ovo je u suprotnosti s našim rezultatima koji pokazuju da supstitucije alanina u Pep2 RGA ne mijenjaju njegovu stabilnost in planta. GSK3 u pšenici je ortolog proteina 2 neosjetljivog na brassinosteroide (BIN2) u Arabidopsis 57. BIN2 je negativni regulator BR signalizacije, a BR aktivira njegov signalni put uzrokujući degradaciju BIN2 58. Pokazali smo da tretman BR ne smanjuje stabilnost RGA 59 ili nivoe fosforilacije u Arabidopsis (Dodatna slika 2), što sugerira da je malo vjerovatno da će BIN2 fosforilirati RGA.
Svi kvantitativni podaci su statistički analizirani korištenjem Excela, a značajne razlike su utvrđene korištenjem Studentovog t-testa. Nisu korištene statističke metode za prethodno određivanje veličine uzorka. Nijedan podatak nije isključen iz analize; eksperiment nije bio randomiziran; a istraživači su bili svjesni alokacije tokom eksperimenta i procjene ishoda. Veličine uzoraka su date u legendama slika i u datotekama sa sirovim podacima.
Vrijeme objave: 15. april 2025.