DELLA proteini su očuvaniregulatori rastakoji igraju centralnu ulogu u razvoju biljaka kao odgovor na unutrašnje i eksterne signale. Kao regulatori transkripcije, DELLA se vezuju za faktore transkripcije (TF) i histon H2A preko svojih GRAS domena i regrutiraju se da djeluju na promotore. Nedavne studije su pokazale da je stabilnost DELLA post-translacijsko regulirana pomoću dva mehanizma: poliubikvitinacije izazvane biljnim hormonomgiberelin, što dovodi do njihove brze degradacije i konjugacije sa malim modifikatorom sličnim ubikvitinu (SUMO), što povećava njihovu akumulaciju. Štaviše, DELLA aktivnost se dinamički reguliše pomoću dva različita mehanizma glikozilacije: O-fukozilacija pojačava DELLA-TF interakciju, dok O-vezana modifikacija N-acetilglukozamina (O-GlcNAc) inhibira DELLA-TF interakciju. Međutim, uloga DELLA fosforilacije je nejasna jer su prethodne studije pokazale oprečne rezultate, pri čemu neki sugeriraju da fosforilacija promovira ili potiskuje DELLA degradaciju, a drugi sugeriraju da fosforilacija ne utječe na njihovu stabilnost. Ovdje identifikujemo mjesta fosforilacije u GA1-3 represoru (RGA), AtDELLA, pročišćenom od Arabidopsis thaliana masovnom spektrometrijom i pokazujemo da fosforilacija dva RGA peptida u PolyS i PolyS/T regijama povećava aktivnost RGA promocijom H2A ciljanog vezivanja i RGA asocijacije. Posebno, fosforilacija nije uticala na RGA-TF interakcije ili RGA stabilnost. Naša studija otkriva molekularni mehanizam kojim fosforilacija izaziva DELLA aktivnost.
Naša masena spektrometrijska analiza otkrila je da su i Pep1 i Pep2 bili visoko fosforilirani u RGA u pozadini Ga1 sa nedostatkom GA. Pored ove studije, fosfoproteomske studije su takođe otkrile fosforilaciju Pep1 u RGA, iako njena uloga još nije proučavana53,54,55. Nasuprot tome, fosforilacija Pep2 nije ranije opisana jer se ovaj peptid mogao otkriti samo pomoću RGAGKG transgena. Iako je mutacija m1A, koja je ukinula fosforilaciju Pep1, samo malo smanjila aktivnost RGA u plantaži, imala je aditivni učinak u kombinaciji s m2A u smanjenju aktivnosti RGA (dodatna slika 6). Važno je da je fosforilacija Pep1 značajno smanjena kod mutanta sly1 pojačanog GA u poređenju sa ga1, što sugerira da GA promovira defosforilaciju RGA, smanjujući njegovu aktivnost. Mehanizam kojim GA potiskuje fosforilaciju RGA zahtijeva dalje istraživanje. Jedna od mogućnosti je da se to postiže regulacijom neidentifikovane protein kinaze. Iako su studije pokazale da je ekspresija CK1 protein kinaze EL1 smanjena od strane GA u riži41, naši rezultati pokazuju da mutacije višeg reda homologa Arabidopsis EL1 (AEL1-4) ne smanjuju fosforilaciju RGA. U skladu s našim rezultatima, nedavna fosfoproteomska studija koja je koristila Arabidopsis AEL linije prekomjerne ekspresije i ael trostruki mutant nije identificirala nikakve DELLA proteine kao supstrate ovih kinaza56. Kada smo pripremali rukopis, objavljeno je da GSK3, gen koji kodira GSK3/SHAGGY-sličnu kinazu u pšenici (Triticum aestivum), može fosforilirati DELLA (Rht-B1b)57, iako fosforilacija Rht-B1b pomoću GSK3 nije potvrđena u biljci. In vitro enzimske reakcije u prisustvu GSK3 praćene analizom masene spektrometrije otkrile su tri mjesta fosforilacije smještena između DELLA i GRAS domena Rht-B1b (dodatna slika 3). Supstitucije serina na alanin na sva tri mjesta fosforilacije dovele su do smanjene aktivnosti Rht-B1b u transgenoj pšenici, u skladu s našim nalazima da su supstitucije alanina u Pep2 RGA smanjile aktivnost RGA. Međutim, in vitro testovi degradacije proteina dalje su pokazali da fosforilacija može stabilizirati i Rht-B1b57. Ovo je u suprotnosti s našim rezultatima koji pokazuju da zamjene alanina u Pep2 RGA ne mijenjaju njegovu stabilnost u planta. GSK3 u pšenici je ortolog proteina 2 neosjetljivog na brasinosteroide (BIN2) u Arabidopsisu 57. BIN2 je negativan regulator BR signalizacije, a BR aktivira svoj signalni put uzrokujući degradaciju BIN2 58. Pokazali smo da tretman BR ne smanjuje RGA stabilnosti RGA ph nivoe spplementarylacije 59. 2), što sugerira da je malo vjerovatno da će RGA biti fosforiliran BIN2.
Svi kvantitativni podaci su statistički analizirani korišćenjem Excel-a, a značajne razlike utvrđene su Studentovim t-testom. Nisu korištene statističke metode za prethodno određivanje veličine uzorka. Nijedan podatak nije isključen iz analize; eksperiment nije bio randomiziran; a istraživači su bili svjesni raspodjele tokom eksperimenta i procjene ishoda. Veličine uzoraka su date u legendama slika i u datotekama sirovih podataka.
Vrijeme objave: Apr-15-2025