Ova studija je procijenila letalnost, subletalnost i toksičnost komercijalnihcipermetrinFormulacije za punoglavce bezopasne vrste. U akutnom testu, koncentracije od 100–800 μg/L testirane su tokom 96 sati. U hroničnom testu, prirodno prisutne koncentracije cipermetrina (1, 3, 6 i 20 μg/L) testirane su na smrtnost, nakon čega je uslijedilo testiranje mikronukleusa i nuklearnih abnormalnosti crvenih krvnih zrnaca tokom 7 dana. LC50 komercijalne formulacije cipermetrina za punoglavce bio je 273,41 μg L−1. U hroničnom testu, najviša koncentracija (20 μg L−1) rezultirala je smrtnošću većom od 50%, jer je ubila polovinu testiranih punoglavaca. Mikronukleusni test pokazao je značajne rezultate pri 6 i 20 μg L−1 i otkriveno je nekoliko nuklearnih abnormalnosti, što ukazuje na to da komercijalna formulacija cipermetrina ima genotoksični potencijal protiv P. gracilis. Cipermetrin predstavlja visok rizik za ovu vrstu, što ukazuje na to da može uzrokovati višestruke probleme i utjecati na dinamiku ovog ekosistema kratkoročno i dugoročno. Stoga se može zaključiti da komercijalne formulacije cipermetrina imaju toksične učinke na P. gracilis.
Zbog kontinuiranog širenja poljoprivrednih aktivnosti i intenzivne primjenesuzbijanje štetočinamjere zaštite, vodene životinje su često izložene pesticidima1,2. Zagađenje vodnih resursa u blizini poljoprivrednih polja može utjecati na razvoj i opstanak organizama koji nisu ciljna skupina, poput vodozemaca.
Vodozemci postaju sve važniji u procjeni matrica okoliša. Bezvodne životinje se smatraju dobrim bioindikatorima zagađivača okoliša zbog svojih jedinstvenih karakteristika kao što su složeni životni ciklusi, brze stope rasta larvi, trofički status, propusna koža10,11, ovisnost o vodi za reprodukciju12 i nezaštićena jaja11,13,14. Mala vodena žaba (Physalaemus gracilis), poznata kao plačuća žaba, pokazala se kao bioindikatorska vrsta zagađenja pesticidima4,5,6,7,15. Vrsta se nalazi u stajaćim vodama, zaštićenim područjima ili područjima s varijabilnim staništem u Argentini, Urugvaju, Paragvaju i Brazilu1617 i smatra se stabilnom prema IUCN klasifikaciji zbog svoje široke rasprostranjenosti i tolerancije na različita staništa18.
Subletalni efekti su zabilježeni kod vodozemaca nakon izlaganja cipermetrinu, uključujući promjene u ponašanju, morfologiji i biokemiji kod punoglavaca23,24,25, promijenjenu smrtnost i vrijeme metamorfoze, enzimske promjene, smanjen uspjeh izleganja24,25, hiperaktivnost26, inhibiciju aktivnosti holinesteraze27 i promjene u performansama plivanja7,28. Međutim, studije genotoksičnih efekata cipermetrina kod vodozemaca su ograničene. Stoga je važno procijeniti osjetljivost anuranskih vrsta na cipermetrin.
Zagađenje okoliša utiče na normalan rast i razvoj vodozemaca, ali najozbiljniji štetni učinak je genetsko oštećenje DNK uzrokovano izloženošću pesticidima13. Analiza morfologije krvnih zrnaca važan je bioindikator zagađenja i potencijalne toksičnosti tvari za divlje vrste29. Mikronukleusni test jedna je od najčešće korištenih metoda za određivanje genotoksičnosti hemikalija u okolišu30. To je brza, učinkovita i jeftina metoda koja je dobar pokazatelj kemijskog zagađenja organizama poput vodozemaca31,32 i može pružiti informacije o izloženosti genotoksičnim zagađivačima33.
Cilj ove studije bio je procijeniti toksični potencijal komercijalnih formulacija cipermetrina na male vodene punoglavce korištenjem mikronukleusnog testa i procjene ekološkog rizika.
Kumulativni mortalitet (%) punoglavaca P. gracilis izloženih različitim koncentracijama komercijalnog cipermetrina tokom akutnog perioda testa.
Kumulativni mortalitet (%) punoglavaca P. gracilis izloženih različitim koncentracijama komercijalnog cipermetrina tokom hroničnog testa.
Uočena visoka smrtnost rezultat je genotoksičnih efekata kod vodozemaca izloženih različitim koncentracijama cipermetrina (6 i 20 μg/L), što dokazuje prisustvo mikronukleusa (MN) i nuklearnih abnormalnosti u eritrocitima. Formiranje MN ukazuje na greške u mitozi i povezano je sa slabim vezivanjem hromosoma za mikrotubule, defektima u proteinskim kompleksima odgovornim za unos i transport hromosoma, greškama u segregaciji hromosoma i greškama u popravci oštećenja DNK38,39 i može biti povezano sa oksidativnim stresom izazvanim pesticidima40,41. Druge abnormalnosti su uočene pri svim procijenjenim koncentracijama. Povećanje koncentracija cipermetrina povećalo je nuklearne abnormalnosti u eritrocitima za 5% i 20% pri najnižim (1 μg/L) i najvišim (20 μg/L) dozama. Na primjer, promjene u DNK vrste mogu imati ozbiljne posljedice i za kratkoročno i za dugoročno preživljavanje, što rezultira padom populacije, promijenjenom reproduktivnom sposobnošću, inbridingom, gubitkom genetske raznolikosti i promijenjenim stopama migracije. Svi ovi faktori mogu utjecati na preživljavanje i održavanje vrste42,43. Formiranje eritroidnih abnormalnosti može ukazivati na blokadu citokineze, što rezultira abnormalnom diobom ćelija (dvojedarni eritrociti)44,45; višerežnjevite jezgre su izbočine nuklearne membrane s više režnjeva46, dok druge eritroidne abnormalnosti mogu biti povezane s amplifikacijom DNK, poput nuklearnih bubrega/mjehurića47. Prisustvo eritrocita bez jezgre može ukazivati na poremećen transport kisika, posebno u kontaminiranoj vodi48,49. Apoptoza ukazuje na ćelijsku smrt50.
Druge studije su također pokazale genotoksične efekte cipermetrina. Kabaña i sar.51 pokazali su prisustvo mikronukleusa i nuklearnih promjena kao što su binuklearne ćelije i apoptotičke ćelije u ćelijama Odontophrynus americanus nakon izlaganja visokim koncentracijama cipermetrina (5000 i 10.000 μg L−1) tokom 96 sati. Apoptoza izazvana cipermetrinom također je otkrivena kod P. biligonigerus52 i Rhinella arenarum53. Ovi rezultati ukazuju na to da cipermetrin ima genotoksične efekte na niz vodenih organizama i da MN i ENA test može biti indikator subletalnih efekata na vodozemce i da se može primijeniti na domaće vrste i divlje populacije izložene toksinima12.
Komercijalne formulacije cipermetrina predstavljaju visoku opasnost za okoliš (i akutnu i kroničnu), pri čemu HQ premašuju nivo Agencije za zaštitu okoliša SAD-a (EPA)54, što može negativno utjecati na vrstu ako je prisutno u okolišu. U procjeni kroničnog rizika, NOEC za smrtnost iznosio je 3 μg L−1, što potvrđuje da koncentracije pronađene u vodi mogu predstavljati rizik za vrstu55. Letalni NOEC za larve R. arenarum izložene mješavini endosulfana i cipermetrina iznosio je 500 μg L−1 nakon 168 sati; ova vrijednost se smanjila na 0,0005 μg L−1 nakon 336 sati. Autori pokazuju da što je duža izloženost, to su niže koncentracije koje su štetne za vrstu. Također je važno naglasiti da su vrijednosti NOEC bile veće od onih kod P. gracilis pri istom vremenu izloženosti, što ukazuje na to da je odgovor vrste na cipermetrin specifičan za vrstu. Nadalje, u pogledu smrtnosti, CHQ vrijednost P. gracilis nakon izlaganja cipermetrinu dostigla je 64,67, što je više od referentne vrijednosti koju je postavila Agencija za zaštitu okoliša SAD-a54, a CHQ vrijednost larvi R. arenarum također je bila viša od ove vrijednosti (CHQ > 388,00 nakon 336 sati), što ukazuje na to da proučavani insekticidi predstavljaju visok rizik za nekoliko vrsta vodozemaca. S obzirom na to da P. gracilis zahtijeva približno 30 dana za završetak metamorfoze56, može se zaključiti da proučavane koncentracije cipermetrina mogu doprinijeti smanjenju populacije sprječavanjem zaraženih jedinki da uđu u odraslu ili reproduktivnu fazu u ranoj dobi.
U izračunatoj procjeni rizika mikronukleusa i drugih abnormalnosti jezgre eritrocita, vrijednosti CHQ-a kretale su se od 14,92 do 97,00, što ukazuje na to da cipermetrin ima potencijalni genotoksični rizik za P. gracilis čak i u njegovom prirodnom staništu. Uzimajući u obzir smrtnost, maksimalna koncentracija ksenobiotičkih spojeva podnošljiva za P. gracilis bila je 4,24 μg L−1. Međutim, koncentracije niske do 1 μg/L također su pokazale genotoksične efekte. Ova činjenica može dovesti do povećanja broja abnormalnih jedinki57 i utjecati na razvoj i reprodukciju vrsta u njihovim staništima, što dovodi do smanjenja populacija vodozemaca.
Komercijalne formulacije insekticida cipermetrina pokazale su visoku akutnu i hroničnu toksičnost za P. gracilis. Uočene su veće stope smrtnosti, vjerovatno zbog toksičnih efekata, što dokazuje prisustvo mikronukleusa i abnormalnosti jezgre eritrocita, posebno nazubljenih jezgara, režnjevastih jezgara i vezikularnih jezgara. Pored toga, proučavane vrste pokazale su povećane rizike za okoliš, i akutne i hronične. Ovi podaci, u kombinaciji s prethodnim studijama naše istraživačke grupe, pokazali su da čak i različite komercijalne formulacije cipermetrina i dalje uzrokuju smanjenu aktivnost acetilkolinesteraze (AChE) i butirilkolinesteraze (BChE) i oksidativni stres58, te rezultiraju promjenama u aktivnosti plivanja i oralnim malformacijama59 kod P. gracilis, što ukazuje na to da komercijalne formulacije cipermetrina imaju visoku letalnu i subletalnu toksičnost za ovu vrstu. Hartmann i saradnici60 otkrili su da su komercijalne formulacije cipermetrina bile najtoksičnije za P. gracilis i drugu vrstu istog roda (P. cuvieri) u poređenju s devet drugih pesticida. Ovo ukazuje na to da zakonski odobrene koncentracije cipermetrina za zaštitu okoliša mogu rezultirati visokom smrtnošću i dugoročnim padom populacije.
Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se procijenila toksičnost pesticida za vodozemce, budući da koncentracije pronađene u okolišu mogu uzrokovati visoku smrtnost i predstavljati potencijalni rizik za P. gracilis. Treba podsticati istraživanje vrsta vodozemaca, jer su podaci o ovim organizmima oskudni, posebno o brazilskim vrstama.
Test hronične toksičnosti trajao je 168 sati (7 dana) pod statičkim uslovima, a subletalne koncentracije su bile: 1, 3, 6 i 20 μg ai L−1. U oba eksperimenta, 10 punoglavaca po tretiranoj grupi je procijenjeno sa šest ponavljanja, za ukupno 60 punoglavaca po koncentraciji. U međuvremenu, tretman samo vodom služio je kao negativna kontrola. Svaka eksperimentalna postavka sastojala se od sterilne staklene posude kapaciteta 500 ml i gustine od 1 punoglavca na 50 ml rastvora. Tikvica je bila prekrivena polietilenskom folijom kako bi se spriječilo isparavanje i kontinuirano je prozračivana.
Voda je hemijski analizirana kako bi se odredile koncentracije pesticida u 0, 96 i 168 sati. Prema Sabinu i saradnicima 68 i Martinsu i saradnicima 69, analize su provedene u Laboratoriji za analizu pesticida (LARP) Federalnog univerziteta Santa Maria korištenjem plinske hromatografije povezane s trostrukom kvadrupolnom masenom spektrometrijom (Varian model 1200, Palo Alto, Kalifornija, SAD). Kvantitativno određivanje pesticida u vodi prikazano je kao dodatni materijal (Tabela SM1).
Za mikronukleusni test (MNT) i test nuklearnih abnormalnosti eritrocita (RNA), analizirano je 15 punoglavaca iz svake tretirane grupe. Punoglavci su anestezirani sa 5% lidokainom (50 mg g-170), a uzorci krvi su prikupljeni srčanom punkcijom pomoću jednokratnih hepariniziranih šprica. Razmazi krvi su pripremljeni na sterilnim mikroskopskim pločicama, osušeni na zraku, fiksirani sa 100% metanolom (4 °C) tokom 2 minute, a zatim obojeni 10% Giemsa rastvorom tokom 15 minuta u mraku. Na kraju procesa, pločice su isprane destilovanom vodom kako bi se uklonio višak boje i osušene na sobnoj temperaturi.
Najmanje 1000 eritrocita iz svakog punoglavca analizirano je korištenjem mikroskopa od 100× sa objektivom od 71 kako bi se utvrdilo prisustvo MN i ENA. Ukupno 75.796 eritrocita iz punoglavaca procijenjeno je uzimajući u obzir koncentracije cipermetrina i kontrole. Genotoksičnost je analizirana prema metodi Carrasca i sar. i Fenecha i sar.38,72 određivanjem učestalosti sljedećih nuklearnih lezija: (1) anuklearne ćelije: ćelije bez jezgara; (2) apoptotičke ćelije: fragmentacija jezgra, programirana ćelijska smrt; (3) binuklearne ćelije: ćelije sa dva jezgra; (4) nuklearni pupoljci ili ćelije mjehurića: ćelije sa jezgrima sa malim izbočinama nuklearne membrane, mjehurići slične veličine kao mikrojezgre; (5) kariolizirane ćelije: ćelije samo sa obrisom jezgra bez unutrašnjeg materijala; (6) zarezane ćelije: ćelije sa jezgrima sa očiglednim pukotinama ili zarezima u svom obliku, koje se nazivaju i jezgre u obliku bubrega; (7) režnjaste ćelije: ćelije sa nuklearnim izbočinama većim od prethodno spomenutih vezikula; i (8) mikroćelije: ćelije sa kondenzovanim jezgrima i smanjenom citoplazmom. Promjene su upoređene sa rezultatima negativne kontrole.
Rezultati testa akutne toksičnosti (LC50) analizirani su korištenjem GBasic softvera i TSK-Trimmed Spearman-Karber metode74. Podaci hroničnog testa prethodno su testirani na normalnost greške (Shapiro-Wilks) i homogenost varijanse (Bartlett). Rezultati su analizirani korištenjem jednosmjerne analize varijanse (ANOVA). Tukeyjev test je korišten za međusobno poređenje podataka, a Dunnettov test je korišten za poređenje podataka između tretirane grupe i negativne kontrolne grupe.
Podaci LOEC i NOEC analizirani su Dunnettovim testom. Statistički testovi su provedeni korištenjem Statistica 8.0 softvera (StatSoft) sa nivoom značajnosti od 95% (p < 0,05).
Vrijeme objave: 13. mart 2025.