Ova studija je procijenila smrtnost, subletalitet i toksičnost komercijalnih proizvodacipermetrinformulacije za anuran punoglavce. U akutnom testu, koncentracije od 100–800 μg/L testirane su 96 h. U kroničnom testu, prirodne koncentracije cipermetrina (1, 3, 6 i 20 μg/L) su testirane na mortalitet, nakon čega je uslijedilo mikronukleusno testiranje i nuklearne abnormalnosti crvenih krvnih zrnaca tijekom 7 dana. LC50 komercijalne formulacije cipermetrina za punoglavce bio je 273,41 μg L-1. U hroničnom testu, najveća koncentracija (20 μg L-1) rezultirala je većom od 50% smrtnosti, jer je ubila polovinu testiranih punoglavaca. Mikronukleus test je pokazao značajne rezultate pri 6 i 20 μg L-1 i otkriveno je nekoliko nuklearnih abnormalnosti, što ukazuje da komercijalna formulacija cipermetrina ima genotoksični potencijal protiv P. gracilis. Cipermetrin predstavlja visok rizik za ovu vrstu, što ukazuje da može uzrokovati višestruke probleme i uticati na dinamiku ovog ekosistema u kratkom i dugoročnom periodu. Stoga se može zaključiti da komercijalne formulacije cipermetrina imaju toksične učinke na P. gracilis.
Zbog kontinuiranog širenja poljoprivrednih djelatnosti i intenzivne primjenekontrola štetočinamjere, vodene životinje su često izložene pesticidima1,2. Zagađenje vodnih resursa u blizini poljoprivrednih polja može uticati na razvoj i opstanak neciljanih organizama kao što su vodozemci.
Vodozemci postaju sve važniji u procjeni ekoloških matrica. Anurani se smatraju dobrim bioindikatorima zagađivača životne sredine zbog svojih jedinstvenih karakteristika kao što su složeni životni ciklusi, brzi rast larvi, trofički status, propusna koža10,11, zavisnost od vode za reprodukciju12 i nezaštićena jaja11,13,14. Mala vodena žaba (Physalaemus gracilis), poznata kao žaba uplakana, pokazala se kao bioindikatorska vrsta zagađenja pesticidima4,5,6,7,15. Vrsta se nalazi u stajaćim vodama, zaštićenim područjima ili područjima sa promjenjivim staništima u Argentini, Urugvaju, Paragvaju i Brazilu1617 i smatra se stabilnom prema IUCN klasifikaciji zbog svoje široke rasprostranjenosti i tolerancije na različita staništa18.
Subletalni efekti su prijavljeni kod vodozemaca nakon izlaganja cipermetrinu, uključujući promjene u ponašanju, morfološke i biokemijske promjene kod punoglavaca23,24,25, promijenjen mortalitet i vrijeme metamorfoze, enzimske promjene, smanjeni uspjeh izleganja24,25, hiperaktivnost26, inhibiciju aktivnosti holinsteraze 77 i promjene u plivanju. Međutim, studije o genotoksičnim efektima cipermetrina na vodozemce su ograničene. Stoga je važno procijeniti osjetljivost vrsta anura na cipermetrin.
Zagađenje okoliša utječe na normalan rast i razvoj vodozemaca, ali najozbiljniji štetni učinak je genetsko oštećenje DNK uzrokovano izlaganjem pesticidima13. Analiza morfologije krvnih stanica važan je bioindikator zagađenja i potencijalne toksičnosti tvari za divlje vrste29. Mikronukleusni test je jedna od najčešće korištenih metoda za određivanje genotoksičnosti kemikalija u okolišu30. To je brza, efikasna i jeftina metoda koja je dobar pokazatelj hemijskog zagađenja organizama kao što su vodozemci31,32 i može pružiti informacije o izloženosti genotoksičnim zagađivačima33.
Cilj ove studije bio je procijeniti toksični potencijal komercijalnih formulacija cipermetrina za male vodene punoglavce koristeći mikronukleus test i procjenu ekološkog rizika.
Kumulativna smrtnost (%) punoglavaca P. gracilis izloženih različitim koncentracijama komercijalnog cipermetrina tokom akutnog perioda testa.
Kumulativna smrtnost (%) punoglavaca P. gracilis izloženih različitim koncentracijama komercijalnog cipermetrina tokom hroničnog testa.
Uočeni visoki mortalitet rezultat je genotoksičnih efekata kod vodozemaca izloženih različitim koncentracijama cipermetrina (6 i 20 μg/L), o čemu svjedoči prisustvo mikronukleusa (MN) i nuklearnih abnormalnosti u eritrocitima. Formiranje MN ukazuje na greške u mitozi i povezano je sa slabim vezivanjem hromozoma za mikrotubule, defektima proteinskih kompleksa odgovornih za unos i transport hromozoma, greškama u segregaciji hromozoma i greškama u popravljanju oštećenja DNK38,39 i može biti povezano sa pesticidima izazvanim oksidativnim stresom,4041. Druge abnormalnosti su uočene pri svim procijenjenim koncentracijama. Povećanje koncentracije cipermetrina povećalo je nuklearne abnormalnosti u eritrocitima za 5% i 20% pri najnižim (1 μg/L) i najvišim (20 μg/L) dozama, respektivno. Na primjer, promjene u DNK vrste mogu imati ozbiljne posljedice kako na kratkoročno tako i na dugotrajno preživljavanje, što rezultira smanjenjem populacije, promijenjenom reproduktivnom sposobnosti, inbreedingom, gubitkom genetske raznolikosti i izmijenjenim stopama migracije. Svi ovi faktori mogu uticati na opstanak i održavanje vrsta42,43. Formiranje eritroidnih abnormalnosti može ukazivati na blokadu citokineze, što rezultira abnormalnom diobom stanica (binukleirani eritrociti)44,45; višerežna jezgra su izbočine nuklearne membrane s više režnjeva46, dok druge eritroidne abnormalnosti mogu biti povezane s amplifikacijom DNK, kao što su nuklearni bubrezi/mjehurići47. Prisustvo eritrocita bez jezgre može ukazivati na poremećen transport kiseonika, posebno u kontaminiranoj vodi48,49. Apoptoza ukazuje na smrt ćelije50.
Druge studije su takođe pokazale genotoksične efekte cipermetrina. Kabaña et al.51 su demonstrirali prisustvo mikronukleusa i nuklearnih promjena kao što su dvonuklearne ćelije i apoptotske ćelije u ćelijama Odontophrynus americanus nakon izlaganja visokim koncentracijama cipermetrina (5000 i 10,000 μg L-1) tokom 96 sati. Cipermetrinom inducirana apoptoza je također otkrivena u P. biligonigerus52 i Rhinella arenarum53. Ovi rezultati upućuju na to da cipermetrin ima genotoksične učinke na niz vodenih organizama i da MN i ENA testovi mogu biti pokazatelj subletalnih učinaka na vodozemce i može biti primjenjiv na autohtone vrste i divlje populacije izložene toksičnim tvarima12.
Komercijalne formulacije cipermetrina predstavljaju visoku opasnost za okoliš (akutnu i kroničnu), sa sjedištem koje premašuje nivo američke Agencije za zaštitu okoliša (EPA)54, što može negativno utjecati na vrstu ako je prisutna u okolišu. U procjeni hroničnog rizika, NOEC za mortalitet je bio 3 μg L−1, što potvrđuje da koncentracije pronađene u vodi mogu predstavljati rizik za vrstu55. Smrtonosni NOEC za larve R. arenarum izložene mješavini endosulfana i cipermetrina bio je 500 μg L-1 nakon 168 h; ova vrijednost se smanjila na 0,0005 μg L−1 nakon 336 h. Autori pokazuju da što je duže izlaganje, to su niže koncentracije koje su štetne za vrstu. Također je važno naglasiti da su vrijednosti NOEC bile veće od vrijednosti P. gracilis u isto vrijeme izlaganja, što ukazuje da je odgovor vrste na cipermetrin specifičan za vrstu. Nadalje, u pogledu mortaliteta, CHQ vrijednost P. gracilis nakon izlaganja cipermetrinu dostigla je 64,67, što je više od referentne vrijednosti koju je postavila Američka agencija za zaštitu okoliša54, a CHQ vrijednost larvi R. arenarum također je bila viša od ove vrijednosti (CHQ > 388,00 h) koji predstavlja visok rizik nakon proučavanja3333. na nekoliko vrsta vodozemaca. Uzimajući u obzir da je P. gracilis potrebno oko 30 dana da završi metamorfozu56, može se zaključiti da proučavane koncentracije cipermetrina mogu doprinijeti smanjenju populacije sprečavajući zaražene osobe da uđu u odraslu ili reproduktivnu fazu u ranoj dobi.
U izračunatoj procjeni rizika od mikronukleusa i drugih nuklearnih abnormalnosti eritrocita, vrijednosti CHQ kretale su se od 14,92 do 97,00, što ukazuje da cipermetrin ima potencijalni genotoksični rizik za P. gracilis čak iu svom prirodnom staništu. Uzimajući u obzir mortalitet, maksimalna koncentracija ksenobiotskih jedinjenja podnošljivih za P. gracilis bila je 4,24 μg L−1. Međutim, koncentracije od samo 1 μg/L također su pokazale genotoksične učinke. Ova činjenica može dovesti do povećanja broja abnormalnih jedinki57 i uticati na razvoj i reprodukciju vrsta u njihovim staništima, što dovodi do smanjenja populacija vodozemaca.
Komercijalne formulacije insekticida cipermetrina pokazale su visoku akutnu i kroničnu toksičnost za P. gracilis. Zapažene su veće stope mortaliteta, vjerovatno zbog toksičnih efekata, što je dokazano prisustvom mikronukleusa i nuklearnih abnormalnosti eritrocita, posebno nazubljenih jezgara, jezgara sa režnjevima i vezikularnih jezgara. Osim toga, proučavane vrste su pokazale povećane ekološke rizike, akutne i kronične. Ovi podaci, u kombinaciji s prethodnim istraživanjima naše istraživačke grupe, pokazali su da čak i različite komercijalne formulacije cipermetrina i dalje uzrokuju smanjene aktivnosti acetilkolinesteraze (AChE) i butirilholinesteraze (BChE) i oksidativnog stresa58, te rezultiraju promjenama u aktivnosti plivanja i oralnim malformacijama59 u P. gracilis formulacijama, što ukazuje na visoku komercijalnu subtoksičnost lethalpermeta i oksida. ovu vrstu. Hartmann et al. 60 je otkrilo da su komercijalne formulacije cipermetrina najtoksičnije za P. gracilis i drugu vrstu istog roda (P. cuvieri) u usporedbi s devet drugih pesticida. Ovo sugerira da zakonom odobrene koncentracije cipermetrina za zaštitu okoliša mogu rezultirati visokim mortalitetom i dugoročnim smanjenjem populacije.
Potrebne su daljnje studije kako bi se procijenila toksičnost pesticida za vodozemce, jer koncentracije pronađene u okolišu mogu uzrokovati visoku smrtnost i predstavljati potencijalni rizik za P. gracilis. Treba poticati istraživanja o vrstama vodozemaca, jer su podaci o ovim organizmima oskudni, posebno o brazilskim vrstama.
Test hronične toksičnosti je trajao 168 h (7 dana) u statičkim uslovima, a subletalne koncentracije su bile: 1, 3, 6 i 20 μg ai L−1. U oba eksperimenta, 10 punoglavaca po tretiranoj grupi je procijenjeno sa šest ponavljanja, za ukupno 60 punoglavaca po koncentraciji. U međuvremenu, tretman samo vodom poslužio je kao negativna kontrola. Svaka eksperimentalna postavka sastojala se od sterilne staklene posude kapaciteta 500 ml i gustine 1 punoglavac na 50 ml rastvora. Boca je prekrivena polietilenskom folijom kako bi se spriječilo isparavanje i kontinuirano je ventilirana.
Voda je hemijski analizirana da bi se odredile koncentracije pesticida na 0, 96 i 168 h. Prema Sabinu i dr. 68 i Martins et al. 69, analize su obavljene u Laboratoriji za analizu pesticida (LARP) Federalnog univerziteta Santa Maria koristeći plinsku hromatografiju spojenu na trostruku kvadrupolnu masenu spektrometriju (Varian model 1200, Palo Alto, Kalifornija, SAD). Kvantitativno određivanje pesticida u vodi prikazano je kao dopunski materijal (Tablica SM1).
Za mikronukleusni test (MNT) i test nuklearne abnormalnosti crvenih krvnih zrnaca (RNA), analizirano je 15 punoglavaca iz svake tretirane grupe. Punoglavci su anestezirani sa 5% lidokaina (50 mg g-170), a uzorci krvi su sakupljeni srčanom punkcijom pomoću hepariniziranih špriceva za jednokratnu upotrebu. Krvni razmazi su pripremljeni na sterilnim mikroskopskim predmetima, sušeni na vazduhu, fiksirani sa 100% metanolom (4 °C) 2 min, a zatim obojeni 10% rastvorom Giemsa 15 minuta u mraku. Na kraju procesa, stakalca su isprana destilovanom vodom da bi se uklonila višak mrlja i osušena na sobnoj temperaturi.
Najmanje 1000 eritrocita iz svakog punoglavca analizirano je pomoću 100× mikroskopa sa 71 ciljem da se odredi prisustvo MN i ENA. Ukupno je procijenjeno 75.796 eritrocita punoglavaca s obzirom na koncentracije i kontrole cipermetrina. Genotoksičnost je analizirana prema metodi Carrasco et al. i Fenech et al.38,72 određivanjem učestalosti sljedećih nuklearnih lezija: (1) ćelije bez jezgri: ćelije bez jezgra; (2) apoptotičke ćelije: nuklearna fragmentacija, programirana ćelijska smrt; (3) dvonuklearne ćelije: ćelije sa dva jezgra; (4) nuklearni pupoljci ili mjehuriće ćelije: ćelije sa jezgrima s malim izbočinama jezgrene membrane, mjehuriće slične veličine kao mikronukleusi; (5) kariolizirane ćelije: ćelije sa samo obrisom jezgra bez unutrašnjeg materijala; (6) urezane ćelije: ćelije sa jezgrom sa očiglednim pukotinama ili zarezima u svom obliku, koje se nazivaju i jezgra u obliku bubrega; (7) lobularne ćelije: ćelije sa nuklearnim izbočinama većim od prethodno navedenih vezikula; i (8) mikroćelije: ćelije sa kondenzovanim jezgrima i smanjenom citoplazmom. Promjene su upoređene s rezultatima negativne kontrole.
Rezultati ispitivanja akutne toksičnosti (LC50) analizirani su korištenjem GBasic softvera i TSK-Trimmed Spearman-Karber metode74. Podaci kroničnog testa prethodno su testirani na normalnost greške (Shapiro-Wilks) i homogenost varijanse (Bartlett). Rezultati su analizirani jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA). Tukeyjev test je korišten za upoređivanje podataka među njima, a Dunnettov test je korišten za poređenje podataka između tretirane grupe i negativne kontrolne grupe.
Podaci o LOEC i NOEC analizirani su Dunettovim testom. Statistički testovi su obavljeni pomoću softvera Statistica 8.0 (StatSoft) sa nivoom značajnosti od 95% (p < 0,05).
Vrijeme objave: Mar-13-2025