Borova nematoda je karantenski migratorni endoparazit za koji je poznato da uzrokuje ozbiljne ekonomske gubitke u ekosistemima borovih šuma. Ova studija razmatra nematicidno djelovanje halogeniranih indola protiv borovih nematoda i njihov mehanizam djelovanja. Nematicidne aktivnosti 5-jodoindola i avermektina (pozitivna kontrola) protiv borovih nematoda bile su slične i visoke pri niskim koncentracijama (10 μg/mL). 5-jodoindol je smanjio plodnost, reproduktivnu aktivnost, smrtnost embriona i larvi i lokomotorno ponašanje. Molekularne interakcije liganada sa receptorima hloridnih kanala koji su specifični za beskičmenjake podržavaju ideju da se 5-jodoindol, poput avermektina, čvrsto vezuje za aktivno mjesto receptora. 5-jodoindol je također izazvao različite fenotipske deformacije kod nematoda, uključujući abnormalni kolaps/skupljanje organa i povećanu vakuolizaciju. Ovi rezultati sugeriraju da vakuole mogu igrati ulogu u smrti uzrokovanoj metilacijom nematoda. Važno je napomenuti da 5-jodoindol nije bio toksičan za obje biljne vrste (kupus i rotkvu). Dakle, ova studija pokazuje da primjena jodoindola u uvjetima okoline može kontrolisati ozljedu borovog uvenuća.
Nematoda borove šume (Bursaphelenchus xylophilus) pripada nematodama borove šume (PWN), migratornim endoparazitskim nematodama za koje je poznato da uzrokuju teška ekološka oštećenja ekosistema borovih šuma1. Bolest borovog uvenuća (PWD) uzrokovana nematodom borove šume postaje ozbiljan problem na nekoliko kontinenata, uključujući Aziju i Evropu, au Sjevernoj Americi nematoda uništava introducirane vrste bora1,2. Propadanje borova je veliki ekonomski problem, a izgledi njegovog globalnog širenja su zabrinjavajući3. Nematoda najčešće napada sljedeće vrste bora: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii i Pinus radiata4. Borova nematoda je ozbiljna bolest koja može ubiti borove u roku od nekoliko sedmica ili mjeseci nakon infekcije. Osim toga, epidemije borovih nematoda su česte u različitim ekosistemima, tako da su uspostavljeni uporni lanci infekcije1.
Bursaphelenchus xylophilus je karantinska biljno-parazitska nematoda koja pripada superfamiliji Aphelenchoidea i klade 102.5. Nematoda se hrani gljivama i razmnožava u drvenom tkivu borova, razvijajući se u četiri različita stadija larve: L1, L2, L3, L4 i odraslu jedinku1,6. U uslovima nestašice hrane, borova nematoda prelazi u specijalizovani stadij larve – dauer, koji parazitira na svom vektoru – borovu potkornjaču (Monochamus alternatus) i prenosi se na zdrava stabla bora. Kod zdravih domaćina nematode brzo migriraju kroz biljna tkiva i hrane se parenhimatoznim stanicama, što dovodi do brojnih reakcija preosjetljivosti, uvenuća bora i smrti u roku od godinu dana nakon infekcije1,7,8.
Biološka kontrola borovih nematoda dugo je predstavljala izazov, a mjere karantina datiraju još iz 20. stoljeća. Trenutne strategije za suzbijanje borovih nematoda prvenstveno uključuju hemijske tretmane, uključujući fumigaciju drveta i implantaciju nematicida u stabla drveća. Najčešće korišteni nematicidi su avermektin i avermektin benzoat, koji pripadaju porodici avermektina. Ove skupe hemikalije su veoma efikasne protiv mnogih vrsta nematoda i smatraju se ekološki bezbednim9. Međutim, očekuje se da će ponovljena upotreba ovih nematicida stvoriti pritisak selekcije koji će gotovo sigurno dovesti do pojave otpornih borovih nematoda, kao što je pokazano za nekoliko štetočina insekata, kao što su Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella i nematode Trichostrongylus colubriformis i Ostertagia circum, koje su postepeno razvile otpornost na avermektini10,11,12. Stoga je potrebno redovno proučavati obrasce otpornosti i kontinuirano provjeravati nematicide kako bi se pronašle alternativne, isplative i ekološki prihvatljive mjere za kontrolu PVD-a. Posljednjih desetljeća, brojni autori su predložili korištenje biljnih ekstrakata, eteričnih ulja i hlapljivih tvari kao sredstava za kontrolu nematoda13,14,15,16.
Nedavno smo demonstrirali nematicidnu aktivnost indola, međućelijske i međukraljevske signalne molekule, u Caenorhabditis elegans 17 . Indol je široko rasprostranjen intracelularni signal u mikrobnoj ekologiji, kontrolirajući brojne funkcije koje utječu na fiziologiju mikroba, formiranje spora, stabilnost plazmida, otpornost na lijekove, formiranje biofilma i virulenciju 18, 19 . Aktivnost indola i njegovih derivata protiv drugih patogenih nematoda nije proučavana. U ovoj studiji istražili smo nematicidnu aktivnost 34 indola protiv borovih nematoda i razjasnili mehanizam djelovanja najmoćnijeg 5-jodoindola pomoću mikroskopije, time-lapse fotografije i molekularnog spajanja eksperimenata, te procijenili njegove toksične učinke na biljke pomoću testa klijanja sjemena.
Ranije je prijavljeno da visoke koncentracije (>1,0 mM) indola imaju nematicidni efekat na nematode17. Nakon tretmana B. xylophilus (mješoviti životni stadiji) indolom ili 33 različita derivata indola u 1 mM, mortalitet B. xylophilus je mjeren prebrojavanjem živih i mrtvih nematoda u kontrolnoj i tretiranoj grupi. Pet indola je pokazalo značajnu nematicidnu aktivnost; preživljavanje netretirane kontrolne grupe bilo je 95 ± 7% nakon 24 h. Od 34 testirana indola, 5-jodoindol i 4-fluoroindol u dozi od 1 mM uzrokovali su 100% smrtnosti, dok su 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-karboksilat i 7-jodoindol uzrokovali oko 50% smrtnosti (Tabela 1).
Utjecaj 5-jodoindola na formiranje vakuola i metabolizam nematode borove šume. (A) Utjecaj avermektina i 5-jodoindola na odrasle muške nematode, (B) jaja nematoda u L1 fazi i (C) metabolizam B. xylophilus, (i) vakuole nisu uočene u 0 h, tretman je rezultirao (ii) vakuolama, (iii) akumulacijom višestrukih vacuolesa (iii) (v) fuziju vakuola i (vi) formiranje džinovskih vakuola. Crvene strelice označavaju oticanje vakuola, plave strelice označavaju fuziju vakuola, a crne strelice ukazuju na ogromne vakuole. Skala bar = 50 μm.
Osim toga, ova studija je također opisala sekvencijalni proces smrti izazvane metanom kod borovih nematoda (slika 4C). Metanogena smrt je neapoptotični tip ćelijske smrti povezan sa akumulacijom istaknutih citoplazmatskih vakuola27. Čini se da su morfološki defekti uočeni kod borovih nematoda usko povezani s mehanizmom smrti uzrokovane metanom. Mikroskopsko ispitivanje u različito vrijeme pokazalo je da su se džinovske vakuole formirale nakon 20 sati izlaganja 5-jodoindolu (0,1 mM). Mikroskopske vakuole su uočene nakon 8 h tretmana, a njihov broj se povećao nakon 12 h. Nekoliko velikih vakuola je uočeno nakon 14 h. Nekoliko spojenih vakuola bilo je jasno vidljivo nakon 12-16 h tretmana, što ukazuje da je fuzija vakuola osnova metanogenog mehanizma smrti. Nakon 20 sati, nekoliko džinovskih vakuola je pronađeno u cijelom crvu. Ova zapažanja predstavljaju prvi izvještaj o metuozi kod C. elegans.
Kod crva tretiranih 5-jodoindolom, takođe je uočena agregacija i ruptura vakuole (slika 5), što je dokazano savijanjem crva i oslobađanjem vakuole u okolinu. Poremećaj vakuole također je primijećen u membrani ljuske jajeta, koja je normalno očuvana netaknutom od strane L2 tokom izleganja (dopunska slika S2). Ova zapažanja podržavaju uključivanje akumulacije tečnosti i osmoregulatornog neuspjeha, kao i reverzibilnu ćelijsku ozljedu (RCI), u procesu formiranja vakuola i suppurationa (slika 5).
Postavljajući hipotezu o ulozi joda u uočenom formiranju vakuola, istražili smo nematicidnu aktivnost natrijum jodida (NaI) i kalijum jodida (KI). Međutim, pri koncentracijama (0,1, 0,5 ili 1 mM), oni nisu utjecali ni na preživljavanje nematoda niti na formiranje vakuola (dopunska slika S5), iako je 1 mM KI imao blagi nematicidni učinak. S druge strane, 7-jodoindol (1 ili 2 mM), poput 5-jodoindola, inducirao je višestruke vakuole i strukturne deformacije (dodatna slika S6). Dva jodoindola su pokazala slične fenotipske karakteristike kod borovih nematoda, dok NaI i KI nisu. Zanimljivo je da indol nije inducirao stvaranje vakuola u B. xylophilus u testiranim koncentracijama (podaci nisu prikazani). Dakle, rezultati su potvrdili da je kompleks indol-jod odgovoran za vakuolizaciju i metabolizam B. xylophilus.
Među indolima testiranim na nematicidnu aktivnost, 5-jodoindol je imao najveći indeks klizanja od -5,89 kcal/mol, a slijede ga 7-jodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) i indol (-4,03) (Slika 6). Snažna vodonična veza 5-jodoindola za leucin 218 stabilizuje njegovo vezivanje, dok se svi ostali derivati indola vezuju za serin 260 preko vodoničnih veza bočnog lanca. Među ostalim modeliranim jodoindolima, 2-jodoindol ima vezujuću vrijednost od -5,248 kcal/mol, što je zbog njegove glavne vodonične veze sa leucinom 218. Ostala poznata vezivanja uključuju 3-jodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindol (-2,6,6 kcal) i fluor. kcal/mol) (Dopunska slika S8). Većina halogeniranih indola i samog indola, sa izuzetkom 5-jodoindola i 2-jodoindola, formiraju vezu sa serinom 260. Činjenica da vodonična veza sa leucinom 218 ukazuje na efikasno vezivanje receptor-ligand, kao što je uočeno za ivermektin (Sl. 2-jodoindol, poput ivermektina, se čvrsto vezuje za aktivno mjesto GluCL receptora preko leucina 218 (slika 6 i dodatna slika S8). Predlažemo da je ovo vezivanje potrebno za održavanje strukture otvorenih pora GluCL kompleksa i da čvrstim vezivanjem za aktivno mjesto GluCL receptora, 5-jodoindol, 2-jodoindol, avermektin i ivermektin na taj način održavaju jonski kanal otvorenim i omogućavaju uzimanje tekućine.
Molekularno spajanje indola i halogeniranog indola na GluCL. Orijentacije vezivanja (A) indola, (B) 4-fluoroindola, (C) 7-jodoindola i (D) 5-jodoindol liganda za aktivno mjesto GluCL. Protein je predstavljen vrpcom, a vodonične veze okosnice su prikazane kao žute isprekidane linije. (A′), (B′), (C′) i (D′) pokazuju interakcije odgovarajućih liganada sa okolnim aminokiselinskim ostacima, a vodonične veze bočnog lanca su označene ružičastim tačkastim strelicama.
Provedeni su eksperimenti za procjenu toksičnog djelovanja 5-jodoindola na klijanje sjemena kupusa i rotkvice. 5-jodoindol (0,05 ili 0,1 mM) ili avermektin (10 μg/mL) imali su mali ili nikakav uticaj na početno klijanje i nicanje sadnica (Slika 7). Osim toga, nije pronađena značajna razlika između stope klijanja netretiranih kontrola i sjemena tretiranih 5-jodoindolom ili avermektinom. Utjecaj na produljenje središnjeg korijena i broj formiranih bočnih korijena bio je beznačajan, iako je 1 mM (10 puta veća od aktivne koncentracije) 5-jodoindola blago odgodio razvoj bočnih korijena. Ovi rezultati pokazuju da je 5-jodoindol netoksičan za biljne ćelije i da ne ometa procese razvoja biljaka u proučavanim koncentracijama.
Utjecaj 5-jodoindola na klijanje sjemena. Klijanje, nicanje i bočno ukorjenjivanje sjemena B. oleracea i R. raphanistrum na Murashige i Skoog agar podlozi sa ili bez avermektina ili 5-jodoindola. Klijavost je zabilježena nakon 3 dana inkubacije na 22°C.
Ova studija izvještava o nekoliko slučajeva ubijanja nematoda indolima. Važno je da je ovo prvi izvještaj o metilaciji koja izaziva jodoindol (proces uzrokovan nakupljanjem malih vakuola koje se postupno spajaju u džinovske vakuole, što na kraju dovodi do pucanja membrane i smrti) u borovim iglicama, pri čemu jodoindol pokazuje značajna svojstva nematicida slična komercijalnim svojstvima nematicida i nematica.
Ranije je prijavljeno da indoli vrše višestruke signalne funkcije kod prokariota i eukariota, uključujući inhibiciju/formiranje biofilma, preživljavanje bakterija i patogenost19,32,33,34. Nedavno su potencijalni terapijski efekti halogeniranih indola, indol alkaloida i polusintetskih derivata indola privukli veliki istraživački interes35,36,37. Na primjer, pokazalo se da halogenirani indoli ubijaju perzistentne stanice Escherichia coli i Staphylococcus aureus37. Osim toga, od naučnog je interesa proučavati efikasnost halogeniranih indola protiv drugih vrsta, rodova i kraljevstava, a ova studija je korak ka postizanju ovog cilja.
Ovdje predlažemo mehanizam za smrtnost izazvanu 5-jodoindolom kod C. elegans zasnovan na reverzibilnoj ćelijskoj ozljedi (RCI) i metilaciji (Slike 4C i 5). Edematozne promjene kao što su natečenost i vakuolna degeneracija pokazatelji su RCI i metilacije, manifestiraju se kao ogromne vakuole u citoplazmi48,49. RCI ometa proizvodnju energije smanjujući proizvodnju ATP-a, uzrokujući kvar ATPazne pumpe ili ometajući ćelijske membrane i uzrokujući brzi priliv Na+, Ca2+ i vode50,51,52. Intracitoplazmatske vakuole nastaju u životinjskim ćelijama kao rezultat akumulacije tečnosti u citoplazmi usled priliva Ca2+ i vode53. Zanimljivo je da je ovaj mehanizam oštećenja ćelija reverzibilan ako je oštećenje privremeno i ćelije počnu da proizvode ATP u određenom vremenskom periodu, ali ako oštećenje potraje ili se pogorša, ćelije umiru.54 Naša zapažanja pokazuju da nematode tretirane 5-jodoindolom nisu u stanju da obnove normalnu biosintezu nakon izlaganja stresnim uslovima.
Fenotip metilacije izazvan 5-jodoindolom u B. xylophilus može biti posljedica prisustva joda i njegove molekularne distribucije, budući da je 7-jodoindol imao manji inhibitorni učinak na B. xylophilus od 5-jodoindola (tabela 1 i dodatna slika S6). Ovi rezultati su djelimično u skladu sa studijama Maltese et al. (2014), koji je izvijestio da je translokacija piridil dušičnog dijela u indolu s para- na meta-poziciju ukinula vakuolizaciju, inhibiciju rasta i citotoksičnost u U251 stanicama, sugerirajući da je interakcija molekula sa specifičnim aktivnim mjestom u proteinu kritična27,44,45. Interakcije između indola ili halogeniranih indola i GluCL receptora uočene u ovoj studiji također podržavaju ovu ideju, jer je utvrđeno da se 5- i 2-jodoindol jače vezuju za GluCL receptore od ostalih ispitanih indola (Slika 6 i Dodatna slika S8). Utvrđeno je da se jod na drugoj ili petoj poziciji indola vezuje za leucin 218 GluCL receptora preko vodoničnih veza okosnice, dok drugi halogenirani indoli i sam indol formiraju slabe vodonične veze bočnog lanca sa serinom 260 (slika 6). Stoga spekulišemo da lokalizacija halogena igra važnu ulogu u indukciji vakuolne degeneracije, dok čvrsto vezivanje 5-jodoindola drži jonski kanal otvorenim, čime se omogućava brz priliv tečnosti i ruptura vakuole. Međutim, ostaje da se utvrdi detaljan mehanizam djelovanja 5-jodoindola.
Prije praktične primjene 5-jodoindola potrebno je analizirati njegovo toksično djelovanje na biljke. Naši eksperimenti klijanja sjemena pokazali su da 5-jodoindol nije imao negativan utjecaj na klijanje sjemena niti na kasniji razvojni proces pri proučavanim koncentracijama (Slika 7). Dakle, ova studija daje osnovu za korištenje 5-jodoindola u ekološkom okruženju za kontrolu štetnosti borovih nematoda za borove stabla.
Prethodni izvještaji su pokazali da terapija zasnovana na indolu predstavlja potencijalni pristup rješavanju problema rezistencije na antibiotike i progresije raka55. Osim toga, indoli posjeduju antibakterijsko, antikancerogeno, antioksidativno, protuupalno, antidijabetičko, antivirusno, antiproliferativno i antituberkulozno djelovanje i mogu poslužiti kao obećavajuća osnova za razvoj lijekova56,57. Ova studija po prvi put ukazuje na potencijalnu upotrebu joda kao antiparazitskog i anthelmintičkog sredstva.
Avermektin je otkriven prije tri decenije i dobio Nobelovu nagradu 2015. godine, a njegova upotreba kao anthelmintika još uvijek je aktivno u toku. Međutim, zbog brzog razvoja otpornosti na avermektine kod nematoda i štetočina insekata, potrebna je alternativna, jeftina i ekološki prihvatljiva strategija za suzbijanje infekcije borove borove borove. Ova studija također izvještava o mehanizmu pomoću kojeg 5-jodoindol ubija borove nematode i da 5-jodoindol ima nisku toksičnost za biljne stanice, što otvara dobre izglede za njegovu buduću komercijalnu primjenu.
Svi eksperimenti su odobreni od strane Etičkog komiteta Univerziteta Yeungnam, Gyeongsan, Koreja, a metode su izvedene u skladu sa smjernicama Etičkog odbora Univerziteta Yeungnam.
Eksperimenti inkubacije jaja izvedeni su prema utvrđenim procedurama43. Za procjenu stope izleganja (HR), 1 dan stare odrasle nematode (otprilike 100 ženki i 100 mužjaka) prebačene su u Petrijeve posude koje sadrže gljivicu i ostavljene da rastu 24 h. Jaja su zatim izolovana i tretirana sa 5-jodoindolom (0,05 mM i 0,1 mM) ili avermektinom (10 μg/ml) kao suspenzijom u sterilnoj destilovanoj vodi. Ove suspenzije (500 μl; približno 100 jaja) su prebačene u jažice ploče za kulturu tkiva sa 24 jažice i inkubirane na 22 °C. Brojanje L2 je napravljeno nakon 24 sata inkubacije, ali se smatralo mrtvim ako se ćelije nisu pomjerale kada su stimulirane finom platinastom žicom. Ovaj eksperiment je izveden u dvije faze, svaka sa šest ponavljanja. Podaci iz oba eksperimenta su kombinovani i predstavljeni. Procenat HR se izračunava na sljedeći način:
Smrtnost larvi je procijenjena korištenjem prethodno razvijenih procedura. Jaja nematoda su sakupljena, a embrioni su sinhronizovani izležavanjem u sterilnoj destilovanoj vodi da bi se stvorile larve L2 faze. Sinhronizirane larve (približno 500 nematoda) tretirane su 5-jodoindolom (0,05 mM i 0,1 mM) ili avermektinom (10 μg/ml) i uzgojene na B. cinerea Petri pločama. Nakon 48 h inkubacije na 22 °C, nematode su sakupljene u sterilnoj destilovanoj vodi i ispitane na prisustvo L2, L3 i L4 stadijuma. Prisustvo L3 i L4 stadijuma ukazuje na transformaciju larve, dok prisustvo L2 stadijuma ne ukazuje na transformaciju. Slike su dobijene pomoću iRiS™ Digital Cell Imaging System. Ovaj eksperiment je izveden u dvije faze, svaka sa šest ponavljanja. Podaci iz oba eksperimenta su kombinovani i predstavljeni.
Toksičnost 5-jodoindola i avermektina za sjemenke procijenjena je testovima klijanja na Murashige i Skoog agar pločama.62 Sjeme B. oleracea i R. raphanistrum prvo je namočeno u sterilnoj destilovanoj vodi jedan dan, isprano sa 1 ml 100% olla, steriliziranog 3% ml otrovnog od 1% natrijum hipohlorit) 15 min, i isprati pet puta sa 1 ml sterilne vode. Sterilizovano sjeme je zatim presovano na agar ploče za klijanje koje sadrže 0,86 g/l (0,2X) Murashige i Skoog medijuma i 0,7% bakteriološkog agara sa ili bez 5-jodoindola ili avermektina. Ploče su zatim inkubirane na 22 °C, a slike su snimljene nakon 3 dana inkubacije. Ovaj eksperiment je proveden u dvije faze, od kojih je svaka imala šest ponavljanja.
Vrijeme objave: Feb-26-2025