Borova nematoda je karantinski migratorni endoparazit za koji se zna da uzrokuje ozbiljne ekonomske gubitke u ekosistemima borovih šuma. Ova studija ispituje nematocidnu aktivnost halogeniranih indola protiv borovih nematoda i njihov mehanizam djelovanja. Nematocidna aktivnost 5-jodoindola i avermektina (pozitivna kontrola) protiv borovih nematoda bila je slična i visoka pri niskim koncentracijama (10 μg/mL). 5-jodoindol je smanjio plodnost, reproduktivnu aktivnost, embrionalnu i larvalnu smrtnost te lokomotorno ponašanje. Molekularne interakcije liganada sa receptorima glutamat-zavisnih hloridnih kanala specifičnim za beskičmenjake podržavaju ideju da se 5-jodoindol, poput avermektina, čvrsto veže za aktivno mjesto receptora. 5-jodoindol je također izazvao različite fenotipske deformacije kod nematoda, uključujući abnormalni kolaps/skupljanje organa i povećanu vakuolizaciju. Ovi rezultati sugeriraju da vakuole mogu igrati ulogu u smrti posredovanoj metilacijom nematoda. Važno je napomenuti da 5-jodoindol nije bio toksičan za obje biljne vrste (kupus i rotkvicu). Dakle, ova studija pokazuje da primjena jodoindola u uslovima okoline može kontrolisati oštećenja uzrokovana uvenućem bora.
Borova nematoda (Bursaphelenchus xylophilus) pripada borovim nematodama (PWN), migratornim endoparazitskim nematodama za koje se zna da uzrokuju ozbiljnu ekološku štetu ekosistemima borovih šuma1. Bolest uvenuća borova (PWD) koju uzrokuje borova nematoda postaje ozbiljan problem na nekoliko kontinenata, uključujući Aziju i Evropu, a u Sjevernoj Americi nematoda uništava unesene vrste borova1,2. Propadanje borova je veliki ekonomski problem, a izgledi za njeno globalno širenje su zabrinjavajući3. Sljedeće vrste borova najčešće su napadnute nematodom: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii i Pinus radiata4. Borova nematoda je ozbiljna bolest koja može uništiti borove u roku od nekoliko sedmica ili mjeseci od infekcije. Osim toga, izbijanja borovih nematoda su česta u raznim ekosistemima, tako da su uspostavljeni perzistentni lanci infekcije1.
Bursaphelenchus xylophilus je karantenska biljno-parazitska nematoda koja pripada superfamiliji Aphelenchoidea i kladu 102.5. Nematoda se hrani gljivicama i razmnožava u drvenastom tkivu borova, razvijajući se u četiri različita larvalna stadija: L1, L2, L3, L4 i odraslu jedinku1,6. U uslovima nedostatka hrane, borova nematoda prelazi u specijalizovani larvalni stadij – dauer, koji parazitira na svom vektoru – borovom potkornjaku (Monochamus alternatus) i prenosi se na zdrave borove. Kod zdravih domaćina, nematode brzo migriraju kroz biljna tkiva i hrane se parenhimskim ćelijama, što dovodi do niza reakcija preosjetljivosti, venuća bora i uginuća u roku od godinu dana nakon infekcije1,7,8.
Biološka kontrola borovih nematoda dugo je predstavljala izazov, a karantinske mjere datiraju još iz 20. stoljeća. Trenutne strategije za kontrolu borovih nematoda prvenstveno uključuju hemijske tretmane, uključujući fumigaciju drveta i implantaciju nematicida u debla drveća. Najčešće korišteni nematicidi su avermektin i avermektin benzoat, koji pripadaju porodici avermektina. Ove skupe hemikalije su vrlo učinkovite protiv mnogih vrsta nematoda i smatraju se sigurnima za okoliš9. Međutim, očekuje se da će ponovljena upotreba ovih nematicida stvoriti selekcijski pritisak koji će gotovo sigurno dovesti do pojave otpornih borovih nematoda, kao što je dokazano kod nekoliko insekata štetočina, kao što su Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella i nematode Trichostrongylus colubriformis i Ostertagia circumcincta, koje su postepeno razvile otpornost na avermektine10,11,12. Stoga je potrebno redovno proučavati obrasce otpornosti i kontinuirano pregledavati nematicide kako bi se pronašle alternativne, isplative i ekološki prihvatljive mjere za kontrolu PVD-a. U posljednjim decenijama, brojni autori su predložili upotrebu biljnih ekstrakata, eteričnih ulja i isparljivih jedinjenja kao sredstava za suzbijanje nematoda13,14,15,16.
Nedavno smo demonstrirali nematocidnu aktivnost indola, međućelijske i međucarstvene signalne molekule, kod Caenorhabditis elegans 17. Indol je široko rasprostranjeni unutarćelijski signal u mikrobnoj ekologiji, koji kontrolira brojne funkcije koje utječu na mikrobnu fiziologiju, formiranje spora, stabilnost plazmida, otpornost na lijekove, formiranje biofilma i virulenciju 18, 19. Aktivnost indola i njegovih derivata protiv drugih patogenih nematoda nije proučavana. U ovoj studiji istražili smo nematocidnu aktivnost 34 indola protiv borovih nematoda i razjasnili mehanizam djelovanja najpotentnijeg 5-jodoindola koristeći mikroskopiju, time-lapse fotografiju i eksperimente molekularnog dockinga, te procijenili njegove toksične učinke na biljke koristeći test klijanja sjemena.
Prethodno je zabilježeno da visoke koncentracije (>1,0 mM) indola imaju nematocidni učinak na nematode17. Nakon tretmana B. xylophilus (mješoviti životni stadiji) indolom ili 33 različita derivata indola u koncentraciji od 1 mM, smrtnost B. xylophilus mjerena je brojanjem živih i mrtvih nematoda u kontrolnoj i tretiranoj grupi. Pet indola pokazalo je značajnu nematocidnu aktivnost; preživljavanje netretirane kontrolne grupe bilo je 95 ± 7% nakon 24 sata. Od 34 testirana indola, 5-jodoindol i 4-fluoroindol u koncentraciji od 1 mM uzrokovali su 100% smrtnosti, dok su 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-karboksilat i 7-jodoindol uzrokovali približno 50% smrtnosti (Tabela 1).
Učinak 5-jodoindola na formiranje vakuola i metabolizam nematode borovog drveta. (A) Učinak avermektina i 5-jodoindola na odrasle mužjake nematoda, (B) jaja nematode L1 stadija i (C) metabolizam B. xylophilus, (i) vakuole nisu uočene nakon 0 sati, tretman je rezultirao (ii) vakuolama, (iii) akumulacijom više vakuola, (iv) oticanjem vakuola, (v) fuzijom vakuola i (vi) formiranjem gigantskih vakuola. Crvene strelice označavaju oticanje vakuola, plave strelice označavaju fuziju vakuola, a crne strelice označavaju gigantske vakuole. Mjerna traka = 50 μm.
Pored toga, ova studija je također opisala sekvencijalni proces smrti izazvane metanom kod borovih nematoda (Slika 4C). Metanogena smrt je neapoptotski tip ćelijske smrti povezan s akumulacijom istaknutih citoplazmatskih vakuola27. Morfološki defekti uočeni kod borovih nematoda izgleda da su usko povezani s mehanizmom smrti izazvane metanom. Mikroskopski pregled u različitim vremenima pokazao je da su se gigantske vakuole formirale nakon 20 sati izlaganja 5-jodoindolu (0,1 mM). Mikroskopske vakuole su uočene nakon 8 sati tretmana, a njihov broj se povećao nakon 12 sati. Nekoliko velikih vakuola uočeno je nakon 14 sati. Nekoliko spojenih vakuola bilo je jasno vidljivo nakon 12-16 sati tretmana, što ukazuje na to da je fuzija vakuola osnova mehanizma metanogene smrti. Nakon 20 sati, nekoliko gigantskih vakuola pronađeno je u cijeloj glisti. Ova zapažanja predstavljaju prvi izvještaj o metuozi kod C. elegans.
Kod crva tretiranih 5-jodoindolom, također je uočena agregacija i ruptura vakuola (Sl. 5), što je dokazano savijanjem crva i oslobađanjem vakuola u okolinu. Poremećaj vakuola također je uočen u membrani ljuske jajeta, koju L2 normalno čuva netaknutom tokom izleganja (Dopunska slika S2). Ova zapažanja podržavaju uključenost akumulacije tečnosti i osmoregulatornog neuspjeha, kao i reverzibilnog oštećenja ćelija (RCI), u proces formiranja vakuola i gnojenja (Sl. 5).
Postavljajući hipotezu o ulozi joda u uočenom formiranju vakuola, istražili smo nematicidno djelovanje natrijum jodida (NaI) i kalijum jodida (KI). Međutim, pri koncentracijama (0,1, 0,5 ili 1 mM), nisu utjecali ni na preživljavanje nematoda ni na formiranje vakuola (Dopunska slika S5), iako je 1 mM KI imao blagi nematicidni učinak. S druge strane, 7-jodoindol (1 ili 2 mM), poput 5-jodoindola, izazvao je višestruke vakuole i strukturne deformacije (Dopunska slika S6). Dva jodoindola pokazala su slične fenotipske karakteristike kod borovih nematoda, dok NaI i KI nisu. Zanimljivo je da indol nije izazvao formiranje vakuola kod B. xylophilus pri testiranim koncentracijama (podaci nisu prikazani). Dakle, rezultati su potvrdili da je kompleks indol-jod odgovoran za vakuolizaciju i metabolizam B. xylophilus.
Među indolima testiranim na nematocidnu aktivnost, 5-jodoindol je imao najveći indeks klizanja od -5,89 kcal/mol, a slijede ga 7-jodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) i indol (-4,03) (Slika 6). Jaka vodikova veza 5-jodoindola s leucinom 218 stabilizira njegovo vezivanje, dok se svi ostali derivati indola vežu za serin 260 putem vodikovih veza bočnog lanca. Među ostalim modeliranim jodoindolima, 2-jodoindol ima vrijednost vezivanja od -5,248 kcal/mol, što je zbog njegove glavne vodikove veze s leucinom 218. Druga poznata vezivanja uključuju 3-jodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindol (-4,0 kcal/mol) i 6-fluoroindol (-2,6 kcal/mol) (Dodatna slika S8). Većina halogeniranih indola i sam indol, s izuzetkom 5-jodoindola i 2-jodoindola, formiraju vezu sa serinom 260. Činjenica da vodikova veza s leucinom 218 ukazuje na efikasno vezivanje receptora i liganda, kao što je uočeno kod ivermektina (Dopunska slika S7), potvrđuje da se 5-jodoindol i 2-jodoindol, poput ivermektina, čvrsto vežu za aktivno mjesto GluCL receptora putem leucina 218 (Slika 6 i Dopunska slika S8). Pretpostavljamo da je ovo vezivanje potrebno za održavanje otvorene strukture pora GluCL kompleksa i da čvrstim vezivanjem za aktivno mjesto GluCL receptora, 5-jodoindol, 2-jodoindol, avermektin i ivermektin tako održavaju ionski kanal otvorenim i omogućavaju unos tekućine.
Molekularno vezivanje indola i halogeniranog indola za GluCL. Orijentacije vezivanja liganada (A) indola, (B) 4-fluoroindola, (C) 7-jodoindola i (D) 5-jodoindola za aktivno mjesto GluCL-a. Protein je predstavljen trakom, a vodikove veze u osnovnom lancu prikazane su žutim isprekidanim linijama. (A′), (B′), (C′) i (D′) pokazuju interakcije odgovarajućih liganada s okolnim aminokiselinskim ostacima, a vodikove veze bočnog lanca označene su ružičastim isprekidanim strelicama.
Eksperimenti su provedeni kako bi se procijenio toksični učinak 5-jodoindola na klijanje sjemena kupusa i rotkvice. 5-jodoindol (0,05 ili 0,1 mM) ili avermektin (10 μg/mL) imali su mali ili nikakav učinak na početno klijanje i nicanje biljaka (Slika 7). Osim toga, nije pronađena značajna razlika između stope klijanja netretiranih kontrola i sjemena tretiranog 5-jodoindolom ili avermektinom. Učinak na izduživanje glavnog korijena i broj formiranih bočnih korijena bio je beznačajan, iako je 1 mM (10 puta veća od aktivne koncentracije) 5-jodoindola neznatno odgodio razvoj bočnih korijena. Ovi rezultati ukazuju na to da 5-jodoindol nije toksičan za biljne ćelije i ne ometa procese razvoja biljaka pri proučavanim koncentracijama.
Učinak 5-jodoindola na klijanje sjemena. Klijanje, proklijavanje i bočno ukorjenjivanje sjemena B. oleracea i R. raphanistrum na Murashige i Skoog agar podlozi sa ili bez avermektina ili 5-jodoindola. Klijanje je zabilježeno nakon 3 dana inkubacije na 22°C.
Ova studija izvještava o nekoliko slučajeva ubijanja nematoda indolima. Važno je napomenuti da je ovo prvi izvještaj o metilaciji koju indukuje jodoindol (proces uzrokovan nakupljanjem malih vakuola koje se postepeno spajaju u gigantske vakuole, što na kraju dovodi do pucanja membrane i smrti) u borovim iglicama, pri čemu jodoindol pokazuje značajna nematocidna svojstva slična onima komercijalnog nematocida avermektina.
Ranije je objavljeno da indoli imaju višestruke signalne funkcije kod prokariota i eukariota, uključujući inhibiciju/formiranje biofilma, preživljavanje bakterija i patogenost 19, 32, 33, 34. Nedavno su potencijalni terapijski efekti halogeniranih indola, indol alkaloida i polusintetičkih derivata indola privukli opsežan istraživački interes 35, 36, 37. Na primjer, pokazalo se da halogenirani indoli ubijaju perzistentne ćelije Escherichia coli i Staphylococcus aureus 37. Osim toga, od naučnog je interesa proučavati efikasnost halogeniranih indola protiv drugih vrsta, rodova i carstava, a ova studija je korak ka postizanju ovog cilja.
Ovdje predlažemo mehanizam za letalnost izazvanu 5-jodoindolom kod C. elegans, zasnovan na reverzibilnom oštećenju ćelija (RCI) i metilaciji (Slike 4C i 5). Edematozne promjene poput natečenosti i vakuolarne degeneracije su indikatori RCI i metilacije, a manifestuju se kao gigantske vakuole u citoplazmi48,49. RCI ometa proizvodnju energije smanjenjem proizvodnje ATP-a, uzrokujući kvar ATPazne pumpe ili narušavanjem ćelijskih membrana i uzrokujući brzi priliv Na+, Ca2+ i vode50,51,52. Intracitoplazmatske vakuole nastaju u životinjskim ćelijama kao rezultat nakupljanja tečnosti u citoplazmi zbog priliva Ca2+ i vode53. Zanimljivo je da je ovaj mehanizam oštećenja ćelija reverzibilan ako je oštećenje privremeno i ćelije počnu proizvoditi ATP tokom određenog vremenskog perioda, ali ako oštećenje traje ili se pogorša, ćelije umiru.54 Naša zapažanja pokazuju da nematode tretirane 5-jodoindolom nisu u stanju da obnove normalnu biosintezu nakon izlaganja stresnim uslovima.
Metilacijski fenotip izazvan 5-jodoindolom kod B. xylophilus može biti posljedica prisustva joda i njegove molekularne distribucije, budući da je 7-jodoindol imao manji inhibitorni učinak na B. xylophilus nego 5-jodoindol (Tabela 1 i Dodatna slika S6). Ovi rezultati su djelimično u skladu sa studijama Maltesea i saradnika (2014), koji su izvijestili da translokacija piridil dušikovog dijela u indolu iz para- u meta-položaj ukida vakuolizaciju, inhibiciju rasta i citotoksičnost u U251 ćelijama, što sugerira da je interakcija molekule sa specifičnim aktivnim mjestom u proteinu kritična27,44,45. Interakcije između indola ili halogeniranih indola i GluCL receptora uočene u ovoj studiji također podržavaju ovu ideju, jer je utvrđeno da se 5- i 2-jodoindol jače vežu za GluCL receptore od ostalih ispitivanih indola (Slika 6 i Dodatna slika S8). Utvrđeno je da se jod na drugoj ili petoj poziciji indola veže za leucin 218 GluCL receptora putem vodikovih veza u osnovnom lancu, dok drugi halogenirani indoli i sam indol formiraju slabe vodikove veze bočnog lanca sa serinom 260 (Slika 6). Stoga pretpostavljamo da lokalizacija halogena igra važnu ulogu u indukciji vakuolarne degeneracije, dok čvrsto vezivanje 5-jodoindola održava jonski kanal otvorenim, čime omogućava brzi priliv tečnosti i rupturu vakuole. Međutim, detaljan mehanizam djelovanja 5-jodoindola tek treba da se utvrdi.
Prije praktične primjene 5-jodoindola, treba analizirati njegov toksični učinak na biljke. Naši eksperimenti klijanja sjemena pokazali su da 5-jodoindol nije imao negativan učinak na klijanje sjemena ili naknadne procese razvoja pri proučavanim koncentracijama (Slika 7). Stoga, ova studija pruža osnovu za upotrebu 5-jodoindola u ekološkom okruženju za kontrolu štetnosti borovih nematoda za borove.
Prethodni izvještaji su pokazali da terapija na bazi indola predstavlja potencijalni pristup rješavanju problema otpornosti na antibiotike i progresije raka55. Osim toga, indoli posjeduju antibakterijska, antikancerogena, antioksidativna, protuupalna, antidijabetička, antivirusna, antiproliferativna i antituberkulozna djelovanja i mogu poslužiti kao obećavajuća osnova za razvoj lijekova56,57. Ova studija prvi put sugerira potencijalnu upotrebu joda kao antiparazitskog i antihelmintskog sredstva.
Avermektin je otkriven prije tri decenije i osvojio Nobelovu nagradu 2015. godine, a njegova upotreba kao antihelmintika je i dalje aktivno u toku. Međutim, zbog brzog razvoja otpornosti na avermektine kod nematoda i insekata štetočina, potrebna je alternativna, jeftinija i ekološki prihvatljiva strategija za kontrolu infekcije borovom biljkom. Ova studija također izvještava o mehanizmu kojim 5-jodoindol ubija borove nematode i da 5-jodoindol ima nisku toksičnost za biljne ćelije, što otvara dobre izglede za njegovu buduću komercijalnu primjenu.
Sve eksperimente je odobrio Etički komitet Univerziteta Yeungnam u Gyeongsanu u Koreji, a metode su provedene u skladu sa smjernicama Etičkog komiteta Univerziteta Yeungnam.
Eksperimenti inkubacije jaja provedeni su korištenjem utvrđenih procedura43. Da bi se procijenila stopa izleganja (HR), jednodnevne odrasle nematode (približno 100 ženki i 100 mužjaka) prebačene su u Petrijeve zdjelice koje su sadržavale gljivicu i ostavljene da rastu 24 sata. Jaja su zatim izolirana i tretirana 5-jodoindolom (0,05 mM i 0,1 mM) ili avermektinom (10 μg/ml) kao suspenzija u sterilnoj destiliranoj vodi. Ove suspenzije (500 μl; približno 100 jaja) prebačene su u jažice ploče za kulturu tkiva s 24 jažice i inkubirane na 22 °C. Brojanje L2 ćelija izvršeno je nakon 24 sata inkubacije, ali su smatrane mrtvim ako se ćelije nisu pomicale kada su stimulirane finom platinskom žicom. Ovaj eksperiment proveden je u dvije faze, svaka sa šest ponavljanja. Podaci iz oba eksperimenta su kombinirani i prikazani. Procenat HR izračunava se na sljedeći način:
Mortalitet larvi procijenjen je korištenjem prethodno razvijenih procedura. Jaja nematoda su prikupljena, a embrioni su sinhronizovani izleganjem u sterilnoj destilovanoj vodi kako bi se generisale larve L2 stadija. Sinhronizovane larve (približno 500 nematoda) tretirane su 5-jodoindolom (0,05 mM i 0,1 mM) ili avermektinom (10 μg/ml) i uzgajane na Petri pločama B. cinerea. Nakon 48 sati inkubacije na 22 °C, nematode su sakupljene u sterilnoj destilovanoj vodi i pregledane na prisustvo stadija L2, L3 i L4. Prisustvo stadija L3 i L4 ukazivalo je na transformaciju larve, dok prisustvo stadija L2 nije ukazivalo na transformaciju. Slike su dobijene korištenjem iRiS™ Digital Cell Imaging System-a. Ovaj eksperiment je proveden u dvije faze, svaka sa šest ponavljanja. Podaci iz oba eksperimenta su kombinovani i prezentovani.
Toksičnost 5-jodoindola i avermektina za sjeme procijenjena je korištenjem testova klijanja na Murashige i Skoog agar pločama.62 Sjeme B. oleracea i R. raphanistrum prvo je natopljeno u sterilnoj destiliranoj vodi jedan dan, isprano s 1 ml 100% etanola, sterilizirano s 1 ml 50% komercijalnog izbjeljivača (3% natrijum hipohlorit) tokom 15 minuta i isprano pet puta s 1 ml sterilne vode. Sterilizirano sjeme je zatim presovano na agar ploče za klijanje koje su sadržavale 0,86 g/l (0,2X) Murashige i Skoog medija i 0,7% bakteriološkog agara sa ili bez 5-jodoindola ili avermektina. Ploče su zatim inkubirane na 22 °C, a slike su snimljene nakon 3 dana inkubacije. Ovaj eksperiment je proveden u dvije faze, od kojih je svaka imala šest ponavljanja.
Vrijeme objave: 26. februar 2025.