Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje rezultate preporučujemo da koristite noviju verziju vašeg pretraživača (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo stranicu bez stila ili JavaScripta.
Otkriće i korisna upotreba prirodnih proizvoda može pomoći u poboljšanju ljudskog života.Hemikalije koje inhibiraju rast biljaka se široko koriste kao herbicidi za suzbijanje korova.Zbog potrebe upotrebe različitih vrsta herbicida, postoji potreba za identifikacijom spojeva s novim mehanizmima djelovanja.U ovoj studiji otkrili smo novo jedinjenje N-alkoksipirola, kumamonamid, iz Streptomyces werraensis MK493-CF1 i uspostavili kompletan proces sinteze.Testiranjem biološke aktivnosti otkrili smo da je urs-monoaminska kiselina sintetički intermedijer urs-monoamida i potencijalnoinhibitor rasta biljaka.Osim toga, razvili smo različite derivate urbenonske kiseline, uključujući derivat urbeniloksi (UDA), koji ima visoku herbicidnu aktivnost bez negativnog utjecaja na rast HeLa stanica.Također smo otkrili da derivati urmotonske kiseline ometaju biljne mikrotubule;pored toga, KAND utiče na aktinske filamente i izaziva smrt ćelije;Ovi višestruki efekti razlikuju se od onih poznatih inhibitora mikrotubula i sugeriraju novi mehanizam djelovanja ursonske kiseline, što predstavlja važnu prednost u razvoju novih herbicida.
Otkrivanje i praktična primjena korisnih prirodnih proizvoda i njihovih derivata sredstvo je za poboljšanje kvalitete ljudskog života.Sekundarni metaboliti koje proizvode mikroorganizmi, biljke i insekti doveli su do velikog napretka u medicini i poljoprivredi.Mnogi antibiotici i lijekovi protiv leukemije razvijeni su od prirodnih proizvoda.Osim toga, razne vrstepesticida, fungicidi i herbicidi se ekstrahuju iz ovih prirodnih proizvoda za upotrebu u poljoprivredi.Konkretno, herbicidi za suzbijanje korova su važna sredstva za povećanje prinosa usjeva u modernoj poljoprivredi, a različite vrste jedinjenja se već koriste komercijalno.Nekoliko ćelijskih procesa u biljkama, kao što su fotosinteza, metabolizam aminokiselina, sinteza ćelijskog zida, regulacija mitoze, fitohormonska signalizacija ili sinteza proteina, smatraju se tipičnim metama herbicida.Jedinjenja koja inhibiraju funkciju mikrotubula uobičajena su klasa herbicida koji utječu na rast biljaka utječući na mitotičku regulaciju2.
Mikrotubule su komponente citoskeleta i široko su očuvane u eukariotskim ćelijama.Tubulinski heterodimer se sastoji od α-tubulina i β-tubulina koji formiraju linearne protofilamente mikrotubula, sa 13 protofilamenata koji formiraju cilindričnu strukturu.Mikrotubule igraju višestruke uloge u biljnim ćelijama, uključujući određivanje oblika ćelije, deobu ćelije i unutarćelijski transport3,4.Biljne ćelije sadrže mikrotubule ispod interfazne plazma membrane, a za ove takozvane kortikalne mikrotubule se smatra da kontrolišu organizaciju celuloznih mikrofibrila kroz regulaciju kompleksa celulozne sintaze4,5.Kortikalne mikrotubule epidermalnih ćelija korijena, prisutne u zoni brzog izduživanja vrha korijena, smještene su bočno, a celulozna mikrovlakna prate ove mikrotubule i ograničavaju smjer širenja ćelije, čime se pospješuje anizotropno izduživanje stanica.Stoga je funkcija mikrotubula usko povezana s morfologijom biljke.Supstitucije aminokiselina u genima koji kodiraju tubulin uzrokuju iskrivljenje nizova kortikalnih mikrotubula i rast na lijevoj ili desnoj strani kod Arabidopsis 6,7.Slično, mutacije u proteinima povezanim s mikrotubulama koji reguliraju dinamiku mikrotubula također mogu dovesti do iskrivljenog rasta korijena8,9,10,11,12,13.Osim toga, tretman herbicidima koji ometaju mikrotubule kao što je dizopiramid, također poznat kao pretilaklor, također uzrokuje lijevo-strani rast kosog korijena14.Ovi podaci ukazuju da je precizna regulacija funkcije mikrotubula kritična za određivanje smjera rasta biljaka.
Otkrivene su različite vrste inhibitora mikrotubula, a ovi lijekovi su dali značajan doprinos istraživanju citoskeleta, kao i poljoprivredi i medicini2.Konkretno, orizalin, jedinjenja dinitroanilina, dizopiramid, jedinjenja srodna benzamidu i njihovi analozi mogu inhibirati funkciju mikrotubula i na taj način inhibirati rast biljaka.Zbog toga se široko koriste kao herbicidi.Međutim, budući da su mikrotubule važna komponenta biljnih i životinjskih stanica, većina inhibitora mikrotubula je citotoksična za oba tipa stanica.Stoga, uprkos njihovoj priznatoj korisnosti kao herbicidi, ograničen broj antimikrotubulskih agenasa se koristi u praktične svrhe.
Streptomyces je rod porodice Streptomyces, koji uključuje aerobne, gram-pozitivne, filamentozne bakterije i nadaleko je poznat po svojoj sposobnosti da proizvodi širok spektar sekundarnih metabolita.Stoga se smatra jednim od najvažnijih izvora novih biološki aktivnih prirodnih proizvoda.U trenutnoj studiji otkrili smo novo jedinjenje pod nazivom kumamonamid, koje je izolovano iz Streptomyces werraensis MK493-CF1 i S. werraensis ISP 5486. Koristeći spektralnu analizu i punu spektralnu analizu, okarakterisana je struktura kumamonamida i njegov jedinstveni N-alkoksipirolni skelet bio je odlučan.sinteza.Ursmonska kiselina, sintetski intermedijer ursmonoamida i njegovih derivata, inhibira rast i klijanje popularne uzorne biljke Arabidopsis thaliana.U studiji odnosa strukture i aktivnosti otkrili smo da spoj sa C9 modificiranim u ursonsku kiselinu, nazvan noniloksi derivat ursonske kiseline (KAND), značajno pojačava inhibitorni učinak na rast i klijanje.Primjetno je da je novootkriveni inhibitor rasta biljaka također utjecao na rast duhana i jetrenjaka i nije bio citotoksičan za bakterije ili HeLa stanice.Štaviše, neki derivati urmotonske kiseline indukuju izobličeni fenotip korena, što implicira da ovi derivati direktno ili indirektno utiču na mikrotubule.U skladu s ovom idejom, naša zapažanja mikrotubula označenih bilo imunohistohemijski ili fluorescentnim proteinima pokazuju da KAND tretman depolimerizira mikrotubule.Osim toga, tretman derivatima kumamotonske kiseline poremetio je aktinske mikrofilamente.Tako smo otkrili novi inhibitor rasta biljaka čiji jedinstveni mehanizam djelovanja uključuje uništavanje citoskeleta.
Soj MK493-CF1 je izolovan iz tla u Shinagawa-ku, Tokio.Soj MK493-CF1 formirao je dobro razgranati stromalni micelij.Određena je parcijalna sekvenca 16S ribosomalnog RNA gena (1422 bp).Ovaj soj je vrlo sličan S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipičan soj, 99,93%).Na osnovu ovog rezultata utvrđeno je da je ovaj soj usko povezan sa tipom soja S. werraensis.Stoga smo ovaj soj privremeno nazvali S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T takođe proizvodi ista bioaktivna jedinjenja.Kako je bilo malo ranih istraživanja o dobivanju prirodnih proizvoda od ovog mikroorganizma, provedena su daljnja kemijska istraživanja.Nakon kultivacije S. werraensis MK493-CF1 na ječmenoj podlozi fermentacijom u čvrstom stanju na 30°C tokom 14 dana, medijum je ekstrahovan sa 50% EtOH.60 ml uzorka je osušeno da bi se dobilo 59,5 mg sirovog ekstrakta.Sirovi ekstrakt je podvrgnut HPLC reverzne faze da bi se dobio N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid (1, nazvan kumamonamid, 36,0 mg).Ukupna količina 1 je približno 60% sirovog ekstrakta.Stoga smo odlučili detaljno proučiti svojstva kumamotoamida 1.
Kumamonamid 1 je bijeli amorfni prah i masena spektrometrija visoke rezolucije (HRESIMS) potvrđuje C6H8N2O2 (slika 1).C2-supstituirani pirolni fragment ovog jedinjenja karakterizira δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH u 1H NMR spektru: 4,5 Hz , H-5) i δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), a 13C NMR spektar pokazuje prisustvo četiri sp2 atoma ugljika.Prisustvo amidne grupe na poziciji C2 procijenjeno je HMBC korelacijom od C-3 protona do amidnog karbonilnog ugljika na δC 161,1.Pored toga, 1 H i 13 C NMR pikovi na δH 4,10 (3H, S) i δC 68,3 ukazuju na prisustvo N-metoksi grupa u molekulu.Iako tačan položaj metoksi grupe još nije određen spektroskopskom analizom kao što je pojačana spektroskopija razlike i nuklearna Overhauserova skraćenica (NOEDF), N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid je postao prvi kandidat za jedinjenje.
Da bi se odredila ispravna struktura 1, izvršena je totalna sinteza (slika 2a).Tretman komercijalno dostupnog 2-aminopiridina 2 sa m-CPBA rezultirao je odgovarajućim N-oksidom 3 u kvantitativnom prinosu.Nakon 2-aminoazidacije 2, reakcija ciklokondenzacije koju je opisao Abramovich izvedena je u benzenu na 90°C da bi se dobio željeni 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 u gramima.Brzina 60% (dva stepena).15,16.Metilacija i hidroliza 4 zatim daju 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilnu kiselinu (nazvana “kumotonska kiselina”, 6) u dobrom prinosu (70%, dva koraka).Konačno, amidacija preko kiselinskog hlorida intermedijera 6 korištenjem vodenog amonijaka dala je Kumamoto amid 1 u prinosu od 98%.Svi spektralni podaci sintetiziranog 1 bili su slični izolovanom 1, pa je određena struktura 1;
Opća sinteza i analiza biološke aktivnosti urbenamida i urbenske kiseline.(a) Ukupna sinteza Kumamoto amida.(b) Sedam dana stare sadnice divljeg tipa Arabidopsis Columbia (Col) uzgajane su na Murashige i Skoog (MS) pločama koje sadrže kumamonamid 6 ili kumamonamid 1 u naznačenim koncentracijama.Skala bar = 1 cm.
Prvo smo procijenili biološke aktivnosti urbenamida i njegovih međuproizvoda zbog njihove sposobnosti da moduliraju rast biljaka.Dodali smo različite koncentracije ursmonamida 1 ili ursmonske kiseline 6 u MS agar podlogu i uzgajali sadnice Arabidopsis thaliana na ovoj podlozi.Ovi testovi su pokazali da visoke koncentracije (500 μM) 6 inhibiraju rast korijena (slika 2b).Zatim smo generirali različite derivate zamjenom pozicije N1 od 6 i izvršili studije odnosa struktura-aktivnost na njima (proces analogne sinteze opisan je u pratećim informacijama (SI)).Sadnice Arabidopsis uzgajane su na podlozi koja sadrži 50 μM derivata ursonske kiseline i mjerena je dužina korijena.kao što je prikazano na slici.Kao što je prikazano na slikama 3a, b i S1, kumamo kiseline imaju različite dužine linearnih alkoksi lanaca (9, 10, 11, 12 i 13) ili velikih alkoksi lanaca (15, 16 i 17) na poziciji N1.Derivati su pokazali značajnu inhibiciju rasta korijena.Osim toga, otkrili smo da primjena 200 μM 10, 11 ili 17 inhibira klijanje (slike 3c i S2).
Proučavanje odnosa strukture i aktivnosti Kumamoto amida i srodnih jedinjenja.(a) Struktura i shema sinteze analoga.(b) Kvantifikacija dužine korijena 7-dnevnih sadnica uzgojenih na MS mediju sa ili bez 50 μM derivata kumamonamida.Zvezdice označavaju značajne razlike sa lažnim tretmanom (t test, str< 0,05).n>18. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD.nt znači “nije testirano” jer više od 50% sjemena nije klijalo.(c) Kvantifikacija brzine klijanja tretiranog sjemena inkubiranih 7 dana u MS mediju sa ili bez 200 μM kumamonamida i srodnih jedinjenja.Zvjezdica označava značajne razlike s lažnim tretmanom (hi-kvadrat test).n=96.
Zanimljivo je da je dodavanje alkil bočnih lanaca dužih od C9 smanjilo inhibitornu aktivnost, sugerirajući da spojevi povezani s kumamotoičnom kiselinom zahtijevaju bočne lance određene veličine da bi pokazali svoju biološku aktivnost.
Budući da je analiza odnosa strukture i aktivnosti pokazala da je C9 modificiran u ursonsku kiselinu i da je noniloksi derivat ursonske kiseline (u daljem tekstu KAND 11) bio najefikasniji inhibitor rasta biljaka, izvršili smo detaljniju karakterizaciju KAND 11. Tretman Arabidopsis sa 50 μM KAND 11 je gotovo potpuno spriječio klijanje, dok su niže koncentracije (40, 30, 20 ili 10 μM) KAND 11 inhibirali rast korijena na način ovisan o dozi (slika 4a, b).Da bismo testirali da li KAND 11 utiče na održivost meristema korena, ispitali smo meristeme korena obojene propidijum jodidom (PI) i izmerili veličinu površine meristema.Veličina meristema sadnica uzgojenih na podlozi koja sadrži 25 μM KAND-11 bila je 151,1 ± 32,5 μm, dok je veličina meristema sadnica uzgojenih na kontrolnoj podlozi koja sadrži DMSO iznosila 264,7 ± 30,8 μm (slika 4c, d) (slika 4c, d) , što ukazuje da KAND-11 obnavlja ćelijsku aktivnost.širenje.Koren meristem.U skladu s tim, tretman KAND 11 smanjio je količinu markera ćelijske diobe CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signala u korijenskom meristemu (slika 4e) 17 .Ovi rezultati pokazuju da KAND 11 inhibira rast korijena smanjujući aktivnost proliferacije stanica.
Analiza inhibitornog dejstva derivata urbenonske kiseline (derivati urbeniloksi) na rast.(a) 7-dnevne sadnice divljeg tipa Col uzgojene na MS pločama sa naznačenim koncentracijama KAND 11. Skala = 1 cm.(b) Kvantifikacija dužine korijena.Slova označavaju značajne razlike (Tukey HSD test, str< 0,05).n>16. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD.(c) Konfokalna mikroskopija divljeg tipa Col korijena obojenog propidijum jodidom, uzgojenog na MS pločama sa ili bez 25 μM KAND 11. Bijele zagrade označavaju meristem korijena.Skala bar = 100 µm.(d) Kvantifikacija veličine meristema korena (n = 10 do 11).Statističke razlike su određene pomoću t-testa (str< 0,05).Trake predstavljaju prosječnu veličinu meristema.(e) Diferencijalna interferencija kontrastna (DIC) mikroskopija meristema korena koji sadrži konstrukt CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS obojen i obojen na 5 dana starim sadnicama uzgojenim na MS pločama sa ili bez 25 µM KAND testa.
Fitotoksičnost KAND 11 dalje je ispitana korištenjem druge dvosupne biljke, duhana (Nicotiana tabacum), i glavnog uzorka kopnenog biljnog organizma, jetrenjače (Marchantia polymorpha).Kao iu slučaju Arabidopsis, sadnice duhana SR-1 uzgojene na podlozi od 25 μM KAND 11 dale su kraće korijenje (slika 5a).Dodatno, 40 od 48 sjemenki je klijalo na pločama koje sadrže 200 μM KAND 11, dok je svih 48 sjemenki klijalo na lažno tretiranoj podlozi, što ukazuje da su veće koncentracije KAND-a bile značajne (p< 0,05;chi test -kvadrat) inhibirao klijanje duvana.(Sl. 5b).Osim toga, koncentracija KAND 11 koja je inhibirala rast bakterija u jetrenici bila je slična efektivnoj koncentraciji kod Arabidopsis (slika 5c).Ovi rezultati pokazuju da KAND 11 može inhibirati rast raznih biljaka.Zatim smo istražili moguću citotoksičnost spojeva srodnih monoamidu medvjeda u drugim organizmima, odnosno ljudskim HeLa stanicama i Escherichia coli soju DH5α, kao predstavnicima viših životinjskih i bakterijskih stanica.U seriji testova proliferacije ćelija, primetili smo da kumamonamid 1, kumamonamidna kiselina 6 i KAND 11 ne utiču na rast HeLa ili E. coli ćelija u koncentracijama od 100 μM (Slika 5d,e).
Inhibicija rasta KAND 11 kod organizama ne-Arabidopsis.(a) Dvonedeljne presadnice duhana divljeg tipa SR-1 uzgajane su na okomito postavljenim MS pločama koje sadrže 25 μM KAND 11. (b) Dvonedeljne sadnice divljeg tipa SR-1 duhana uzgajane su na horizontalno postavljenim MS ploče koje sadrže 200 μM KAND 11. (c) Dvonedeljni pupoljci jetrenjaka Tak-1 stare divlje vrste uzgojeni na Gamborg B5 pločama sa naznačenim koncentracijama KAND 11. Crvene strelice pokazuju spore koje su prestale da rastu u toku dvonedeljne inkubacije period.(d) Test proliferacije ćelija HeLa ćelija.Broj živih ćelija meren je u fiksnim vremenskim intervalima korišćenjem kompleta za brojanje ćelija 8 (Dojindo).Kao kontrola, HeLa ćelije su tretirane sa 5 μg/ml aktinomicinom D (Act D), koji inhibira transkripciju RNA polimeraze i uzrokuje smrt ćelije.Analize su obavljene u tri primjerka.(e) Test proliferacije ćelija E. coli.Rast E. coli je analiziran mjerenjem OD600.Kao kontrola, ćelije su tretirane sa 50 μg/ml ampicilina (Amp), koji inhibira sintezu ćelijskog zida bakterije.Analize su obavljene u tri primjerka.
Kako bismo dešifrirali mehanizam djelovanja citotoksičnosti uzrokovane spojevima srodnim uramidima, ponovo smo analizirali derivate urbenske kiseline s umjerenim inhibitornim efektima.kao što je prikazano na slici.Kao što je prikazano na slikama 2b, 6a, sadnice uzgojene na agar pločama koje sadrže visoke koncentracije (200 μM) urmotonske kiseline 6 dale su kraće i lijevo zakrivljene korijene (θ = – 23,7 ± 6,1), dok su sadnice uzgojene na kontrolnom mediju, sadnice su dale skoro prave korijene (θ = – 3,8 ± 7,1).Poznato je da je ovaj karakterističan kosi rast rezultat disfunkcije kortikalnih mikrotubula14,18.U skladu s ovim nalazom, lijekovi koji destabiliziraju mikrotubule dizopiramid i orizalin izazvali su slično naginjanje korijena u našim uvjetima rasta (slike 2b, 6a).Istovremeno smo testirali derivate urmotonske kiseline i odabrali nekoliko njih koji u određenim koncentracijama izazivaju kosi rast korijena.Jedinjenja 8, 9 i 15 su promijenila smjer rasta korijena na 75 μM, 50 μM i 40 μM, respektivno, što ukazuje da ova jedinjenja mogu efikasno destabilizirati mikrotubule (sl. 2b, 6a).Također smo testirali najsnažniji derivat ursolne kiseline, KAND 11, u nižoj koncentraciji (15 µM) i otkrili da primjena KAND 11 inhibira rast korijena i da je smjer rasta korijena neujednačen, iako imaju tendenciju naginjanja ulijevo ( Slika C3)..Budući da veće koncentracije lijekova koji destabiliziraju mikrotubule ponekad inhibiraju rast biljaka umjesto da uzrokuju naginjanje korijena, naknadno smo procijenili mogućnost da KAND 11 utječe na mikrotubule promatrajući kortikalne mikrotubule u epidermalnim stanicama korijena.Imunohistohemija upotrebom anti-β-tubulinskih antitela u epidermalnim ćelijama korena sadnica tretiranih sa 25 μM KAND 11 pokazala je nestanak skoro svih kortikalnih mikrotubula u epidermalnim ćelijama u zoni elongacije (slika 6b).Ovi rezultati pokazuju da kumamotonska kiselina i njeni derivati djeluju direktno ili indirektno na mikrotubule kako bi ih poremetili i da su ti spojevi novi inhibitori mikrotubula.
Ursonska kiselina i njeni derivati mijenjaju kortikalne mikrotubule u Arabidopsis thaliana.(a) Ugao nagiba korijena mjeren u prisustvu različitih derivata urmotonske kiseline u naznačenim koncentracijama.Također su analizirani efekti dvaju spojeva za koje je poznato da inhibiraju mikrotubule: dizopiramida i orizalina.Umetak prikazuje standard koji se koristi za mjerenje ugla rasta korijena.Zvezdice označavaju značajne razlike sa lažnim tretmanom (t test, str< 0,05).n>19. Skala = 1 cm.(b) Kortikalne mikrotubule u epidermalnim ćelijama u zoni elongacije.Mikrotubule u korijenu divljeg tipa Arabidopsis Col uzgojene na MS pločama sa ili bez 25 μM KAND 11 vizualizirane su imunohistohemijskim bojenjem korištenjem primarnih antitijela na β-tubulin i sekundarnih antitijela konjugiranih Alexa Fluor.Skala bar = 10 µm.(c) Mitotička struktura mikrotubula u meristemu korena.Mikrotubule su vizualizirane imunohistohemijskim bojenjem.Mitotičke strukture, uključujući profazne zone, vretena i fragmoplaste, izbrojane su iz konfokalnih slika.Strelice pokazuju mitotičke strukture mikrotubula.Zvezdice označavaju značajne razlike sa lažnim tretmanom (t test, str< 0,05).n>9. Skala bar = 50 µm.
Iako Ursa ima sposobnost da poremeti funkciju mikrotubula, očekuje se da će se njen mehanizam djelovanja razlikovati od tipičnih sredstava za depolimerizaciju mikrotubula.Na primjer, veće koncentracije agenasa za depolimerizaciju mikrotubula kao što su dizopiramid i orizalin induciraju anizotropnu ekspanziju epidermalnih stanica, dok KAND 11 ne.Osim toga, zajednička primjena KAND 11 i dizopiramida rezultirala je kombinovanim odgovorom rasta korijena izazvanog disopiramidom i uočena je inhibicija rasta izazvana KAND 11 (slika S4).Također smo analizirali odgovor mutanta hipersenzitivnog dizopiramida 1-1 (phs1-1) na KAND 11. phs1-1 ima nekanonsku tačku mutacije tubulin kinaze i proizvodi kraće korijene kada se liječi dizopiramidom9,20.phs1-1 mutantne sadnice uzgajane na agar podlozi koja sadrži KAND 11 imale su kraće korijene slične onima uzgojenim na dizopiramidi (sl. S5).
Pored toga, uočili smo strukture mitotičkih mikrotubula, kao što su profazne zone, vretena i fragmoplasti, u meristemu korena sadnica tretiranih sa KAND 11. U skladu sa zapažanjima za CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, značajno smanjenje uočen je broj mitotičkih mikrotubula (slika .6c).
Da bismo okarakterisali citotoksičnost KAND 11 pri subćelijskoj rezoluciji, tretirali smo ćelije suspenzije duhana BY-2 sa KAND 11 i posmatrali njihov odgovor.Prvo smo dodali KAND 11 ćelijama BY-2 koje eksprimiraju TagRFP-TUA6, koji fluorescentno obeležava mikrotubule, da bismo procenili efekat KAND 11 na kortikalne mikrotubule.Gustoća kortikalnih mikrotubula procijenjena je analizom slike, koja je kvantificirala postotak citoskeletnih piksela među citoplazmatskim pikselima.Rezultati analize su pokazali da je nakon tretmana sa 50 μM ili 100 μM KAND 11 u trajanju od 1 sata, gustina značajno smanjena na 0,94 ± 0,74% odnosno 0,23 ± 0,28%, dok je gustina ćelija tretiranih DMSO ,631 ±1. % (slika 7a).Ovi rezultati su u skladu sa zapažanjem kod Arabidopsis da tretman KAND 11 indukuje depolimerizaciju kortikalnih mikrotubula (slika 6b).Također smo ispitali BY-2 liniju sa GFP-ABD-obilježenim aktinskim filamentima nakon tretmana s istom koncentracijom KAND 11 i primijetili da tretman KAND 11 poremeti aktinske filamente.Tretman sa 50 μM ili 100 μM KAND 11 tokom 1 h značajno je smanjio gustinu aktinskih filamenata na 1,20 ± 0,62% odnosno 0,61 ± 0,26%, dok je gustina u ćelijama tretiranim DMSO iznosila 1,69 ± 0% (Sl.7b).Ovi rezultati su u suprotnosti sa efektima propizamida, koji ne utiče na aktinske filamente, i latrunculina B, depolimerizatora aktina koji ne utiče na mikrotubule (SI slika S6).Pored toga, tretman sa kumamonamidom 1, kumamonamidnom kiselinom 6 ili KAND 11 nije uticao na mikrotubule u HeLa ćelijama (SI slika S7).Stoga se vjeruje da je mehanizam djelovanja KAND 11 drugačiji od onog kod poznatih disruptora citoskeleta.Osim toga, naše mikroskopsko posmatranje BY-2 ćelija tretiranih KAND 11 otkrilo je početak ćelijske smrti tokom tretmana KAND 11 i pokazalo da se udio mrtvih ćelija obojenih Evans plavom bojom nije značajno povećao nakon 30 minuta tretmana KAND 11, dok nakon 90 minuta tretmana sa 50 μM ili 100 μM KAND, broj mrtvih ćelija se povećao na 43,7% odnosno 80,1% (slika 7c).Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju na to da je novi derivat ursolne kiseline KAND 11 biljno-specifičan citoskeletni inhibitor sa ranije nepoznatim mehanizmom djelovanja.
KAND utiče na kortikalne mikrotubule, aktinske filamente i održivost BY-2 ćelija duvana.(a) Vizualizacija kortikalnih mikrotubula u BY-2 ćelijama u prisustvu TagRFP-TUA6.BY-2 ćelije tretirane sa KAND 11 (50 μM ili 100 μM) ili DMSO su pregledane konfokalnom mikroskopijom.Gustina kortikalnih mikrotubula izračunata je na osnovu mikrosnimaka 25 nezavisnih ćelija.Slova označavaju značajne razlike (Tukey HSD test, str< 0,05).Skala bar = 10 µm.(b) Kortikalni aktinski filamenti u BY-2 ćelijama vizualizirani u prisustvu GFP-ABD2.BY-2 ćelije tretirane sa KAND 11 (50 μM ili 100 μM) ili DMSO su pregledane konfokalnom mikroskopijom.Gustoća kortikalnih aktinskih filamenata izračunata je na osnovu mikrofotografija 25 nezavisnih ćelija.Slova označavaju značajne razlike (Tukey HSD test, str< 0,05).Skala bar = 10 µm.(c) Posmatranje mrtvih BY-2 ćelija Evansovim plavim bojenjem.BY-2 ćelije tretirane sa KAND 11 (50 μM ili 100 μM) ili DMSO ispitane su mikroskopijom u svijetlom polju.n=3.Skala bar = 100 µm.
Otkriće i primjena novih prirodnih proizvoda dovela je do značajnog napretka u različitim aspektima ljudskog života, uključujući medicinu i poljoprivredu.Provedena su istorijska istraživanja kako bi se dobila korisna jedinjenja iz prirodnih resursa.Posebno je poznato da su aktinomiceti korisni kao antiparazitski antibiotici za nematode zbog svoje sposobnosti da proizvode različite sekundarne metabolite kao što je avermektin, olovo jedinjenje ivermektina i bleomicina i njegovih derivata, koji se koristi u medicini kao sredstvo protiv raka21,22.Isto tako, iz aktinomiceta su otkrivena različita herbicidna jedinjenja, od kojih se neki već koriste komercijalno1,23.Stoga se analiza metabolita aktinomiceta za izolaciju prirodnih proizvoda sa željenim biološkim aktivnostima smatra efikasnom strategijom.U ovoj studiji smo otkrili novo jedinjenje, kumamonamid, iz S. werraensis i uspješno ga sintetizirali.Ursonska kiselina je sintetički intermedijer urbenamida i njegovih derivata.Može uzrokovati karakteristično uvijanje korijena, pokazati umjereno do jako herbicidno djelovanje i direktno ili indirektno oštetiti mikrotubule biljaka.Međutim, mehanizam djelovanja urmotonske kiseline može se razlikovati od onog kod postojećih inhibitora mikrotubula, budući da KAND 11 također ometa aktinske filamente i uzrokuje smrt stanica, sugerirajući regulatorni mehanizam kojim urmotonska kiselina i njeni derivati utječu na širok spektar citoskeletnih struktura..
Dalja detaljna karakterizacija urbenonske kiseline pomoći će boljem razumijevanju mehanizma djelovanja urbenonske kiseline.Konkretno, sljedeći cilj je procijeniti sposobnost ursonske kiseline da se veže na reducirane mikrotubule kako bi se utvrdilo da li ursonska kiselina i njeni derivati djeluju direktno na mikrotubule i depolimeriziraju ih, ili njihovo djelovanje rezultira destabilizacijom mikrotubula.Osim toga, u slučaju kada mikrotubule nisu direktna meta, identificiranje mjesta djelovanja i molekularnih ciljeva ursonske kiseline na biljnim stanicama pomoći će daljem razumijevanju svojstava srodnih spojeva i mogućih načina za poboljšanje herbicidne aktivnosti.Naš test bioaktivnosti otkrio je jedinstvenu citotoksičnu sposobnost ursonske kiseline na rast biljaka kao što su Arabidopsis thaliana, duhan i jetrenjak, dok ni E. coli ni HeLa ćelije nisu bile pogođene.Mala ili nikakva toksičnost za životinjske ćelije je prednost derivata ursonske kiseline ako su razvijeni kao herbicidi za upotrebu na otvorenim poljoprivrednim poljima.Zaista, budući da su mikrotubule uobičajene strukture kod eukariota, njihova selektivna inhibicija u biljkama je ključni zahtjev za herbicide.Na primjer, propizamid, sredstvo za depolimerizaciju mikrotubula koje se direktno veže za tubulin i inhibira polimerizaciju, koristi se kao herbicid zbog svoje niske toksičnosti za životinjske stanice24.Za razliku od dizopiramida, srodni benzamidi imaju različite ciljne specifičnosti.Osim biljnih mikrotubula, RH-4032 ili benzoksamid također inhibira mikrotubule životinjskih stanica odnosno oomiceta, a zalilamid se koristi kao fungicid zbog svoje niske fitotoksičnosti25,26,27.Novootkriveni medvjed i njegovi derivati pokazuju selektivnu citotoksičnost protiv biljaka, ali je vrijedno napomenuti da daljnje modifikacije mogu promijeniti njihovu ciljnu specifičnost, potencijalno pružajući dodatne derivate za kontrolu patogenih gljiva ili oomiceta.
Jedinstvena svojstva urbenonske kiseline i njenih derivata su korisna za njihov razvoj kao herbicida i upotrebu kao istraživačkih alata.Važnost citoskeleta u kontroli oblika biljnih ćelija je široko priznata.Ranije studije su pokazale da su biljke razvile složene mehanizme organizacije kortikalnih mikrotubula kontrolirajući dinamiku mikrotubula kako bi pravilno kontrolirale morfogenezu.Identifikovan je veliki broj molekula odgovornih za regulaciju aktivnosti mikrotubula, a srodna istraživanja su još uvijek u toku3,4,28.Naše trenutno razumijevanje dinamike mikrotubula u biljnim stanicama ne objašnjava u potpunosti mehanizme organizacije kortikalnih mikrotubula.Na primjer, iako i disopiramid i orizalin mogu depolimerizirati mikrotubule, dizopiramid uzrokuje ozbiljno izobličenje korijena, dok orizalin ima relativno blag učinak.Štaviše, mutacije u tubulinu, koji stabilizuje mikrotubule, takođe izazivaju dekstrorotaciju u korenu, dok paklitaksel, koji takođe stabilizuje dinamiku mikrotubula, ne.Stoga bi proučavanje i identifikacija molekularnih ciljeva ursolne kiseline trebalo dati novi uvid u regulaciju biljnih kortikalnih mikrotubula.Slično tome, buduća poređenja hemikalija koje su efikasne u promociji poremećenog rasta, kao što je dizopiramid, i manje efikasnih hemikalija, kao što su orizalin ili kumamotorna kiselina, daće naznake o tome kako dolazi do poremećenog rasta.
S druge strane, preuređenje citoskeleta vezano za odbranu je još jedna mogućnost da se objasni citotoksičnost ursonske kiseline.Infekcija patogena ili unošenje elicitora u biljne ćelije ponekad uzrokuje destrukciju citoskeleta i kasniju smrt ćelije29.Na primjer, prijavljeno je da kriptoksantin dobijen iz oomiceta poremeti mikrotubule i aktinske filamente prije smrti duhanskih stanica, slično onome što se događa s KAND tretmanom30,31.Sličnosti između obrambenih odgovora i staničnih odgovora izazvanih ursonskom kiselinom dovele su nas do hipoteze da oni pokreću uobičajene stanične procese, iako je očigledan brži i jači učinak ursonske kiseline od kriptoksantina.Međutim, studije su pokazale da prekid aktinskih filamenata potiče spontanu ćelijsku smrt, koja nije uvijek praćena prekidom mikrotubula29.Osim toga, ostaje da se vidi da li patogen ili elicitor izazivaju izobličeni rast korijena, kao što to čine derivati ursonske kiseline.Stoga je molekularno znanje koje povezuje odbrambene odgovore i citoskelet privlačan problem koji treba riješiti.Koristeći prisustvo jedinjenja male molekularne težine povezanih sa ursonskom kiselinom, kao i niz derivata sa različitim potencijalima, oni mogu pružiti mogućnosti za ciljanje nepoznatih ćelijskih mehanizama.
Uzeto zajedno, otkriće i primjena novih spojeva koji moduliraju dinamiku mikrotubula pružit će moćne metode za rješavanje složenih molekularnih mehanizama koji su u osnovi određivanja oblika biljnih stanica.U tom kontekstu, nedavno razvijeno jedinjenje urmotonska kiselina, koje utječe na mikrotubule i aktinske filamente i inducira ćelijsku smrt, može pružiti priliku za dešifriranje veze između kontrole mikrotubula i ovih drugih mehanizama.Stoga će nam kemijska i biološka analiza korištenjem urbenonske kiseline pomoći da razumijemo molekularne regulatorne mehanizme koji kontroliraju biljni citoskelet.
Inokulirajte S. werraensis MK493-CF1 u Erlenmajerovu tikvicu od 500 mL koja sadrži 110 mL podloge za sjemenje koja se sastoji od 2% (w/v) galaktoze, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) Bacto sastava .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) ekstrakt kukuruza (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 i 0,2% CaCO3 u deioniziranoj vodi.(pH 7,4 prije sterilizacije).Kulture sjemena su inkubirane na rotacionoj mešalici (180 rpm) na 27°C tokom 2 dana.Uzgoj proizvodnje fermentacijom u čvrstom stanju.Kultura sjemena (7 ml) prebačena je u tikvicu od 500 ml K-1 koja je sadržavala 40 g proizvodnog medija koji se sastojao od 15 g presovanog ječma (MUSO Co., Ltd., Japan) i 25 g deionizirane vode (pH nije podešen prije sterilizacije).).Fermentacija je vršena na 30°C u mraku 14 dana.Fermentacijski materijal je ekstrahovan sa 40 ml/boci EtOH i centrifugiran (1500 g, 4°C, 10 min).Supernatant kulture (60 ml) je ekstrahovan sa mešavinom 10% MeOH/EtOAc.Organski sloj je uparen pod sniženim pritiskom da se dobije ostatak (59,5 mg), koji je podvrgnut HPLC-u sa gradijentom eluiranja (0-10 minuta: 90%) na koloni reverzne faze (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × dužina 250 mm) H2O/CH3CN, 10-35 minuta: 90% H2O/CH3CN do 70% H2O/CH3CN (gradijent), 35-45 minuta: 90% H2O/EtOH, 45-155 minuta: 90% H2O /EtOH do 100% EtOH (gradijent (gradijent), 155–200 min: 100% EtOH) pri brzini protoka od 1,5 ml/min, izolovan je kumamonamid (1, 36,0 mg) kao bijeli amorfni prah.
Kumamotoamid(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ izračunata vrijednost: 141,0659, izmjerena vrijednost: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 15.37 cm
Sjeme Columbia (Col-0) dobijeno je od Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) uz dozvolu za istraživačku upotrebu.Sjeme Col-0 razmnožavano je i održavano u našim laboratorijskim uvjetima i korišteno kao biljke divljeg tipa Arabidopsis.Sjeme Arabidopsis je površinski sterilizirano i uzgajano u mediju Murashige i Skoog polu-jače koji sadrži 2% saharoze (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)etansulfonske kiseline (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ).) i 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, na 23 °C i stalnom svjetlu.Sjeme phs1-1 mutanta obezbijedio je T. Hashimoto (Nara Institut za nauku i tehnologiju).
Sjeme soja SR-1 obezbijedio je T. Hashimoto (Nara Institut za nauku i tehnologiju) i korišteno je kao biljke divljeg tipa duhana.Sjeme duhana je površinski sterilizirano i natopljeno u sterilnoj vodi tri noći da bi se potaknulo klijanje, a zatim stavljeno u otopinu upola jačine koja sadrži 2% saharoze, 0,05% (w/v) MES i 0,8% gelanske gume (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.i Skoog medijum) sa pH 5,7 i inkubiran na 23°C pod konstantnom svetlošću.
Soj Tak-1 je obezbijedio T. Kohchi (Kyoto Univerzitet) i korišten je kao standardna eksperimentalna jedinica za studiju o jetrenoj travi.Gemma je dobivena iz steriliziranih kultiviranih biljaka i potom postavljena na podlogu Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) koja sadrži 1% saharoze i 0,3% gelanske gume i inkubirana na 23°C pod kontinuiranom svjetlošću.
Duvan BY-2 ćelije (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) obezbedio je S. Hasezawa (Univerzitet u Tokiju).BY-2 ćelije su razrijeđene 95 puta u modificiranom Linsmeier-ovom i Skoogovom mediju i dopunjene jednom sedmično sa 2,4-dihlorofenoksi-sirćetnom kiselinom 32 .Suspenzija ćelija je mešana na rotacionoj mešalici pri 130 o/min na 27°C u mraku.Isperite ćelije sa 10 puta većom zapreminom svežeg medijuma i resuspendujte u istom medijumu.BY-2 transgene ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju marker mikrotubula TagRFP-TUA6 ili marker aktin filamenta GFP-ABD2 ispod promotora 35S virusa mozaika karfiola generirane su kako je opisano33,34,35.Ove ćelijske linije se mogu održavati i sinkronizirati korištenjem procedura sličnih onima koje se koriste za originalnu BY-2 ćelijsku liniju.
HeLa ćelije su uzgajane u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagle's mediju (DMEM) (Life Technologies) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma, 1,2 U/ml penicilina i 1,2 μg/ml streptomicina u inkubatoru na 37°C sa 5% CO2.
Svi eksperimenti opisani u ovom rukopisu izvedeni su u skladu s japanskim propisima i smjernicama o biološkoj sigurnosti.
Jedinjenja su otopljena u dimetil sulfoksidu (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kao matične otopine i razrijeđena u MS mediju za Arabidopsis i duhan ili Gamborg B5 mediju za jetrenicu.Za test inhibicije rasta korijena, više od 10 sjemenki po ploči posijano je na agar mediju koji sadrži naznačena jedinjenja ili DMSO.Sjeme je inkubirano u komori za rast 7 dana.Sadnice su fotografisane i izmjerena je dužina korijena.Za analizu klijanja Arabidopsis, 48 sjemenki po ploči posijano je na agar podlogu koji sadrži 200 μM spoja ili DMSO.Sjeme Arabidopsis uzgajano je u komori za rast, a broj klijanaca je prebrojan 7 dana nakon nicanja (dag).Za ispitivanje klijavosti duhana, 24 sjemena po ploči posijano je na agar medij koji sadrži 200 μM KAND ili DMSO.Sjeme duhana uzgajano je u komori za uzgoj i broj klijavih sadnica je prebrojan nakon 14 dana.Za test inhibicije rasta jetrenjače, 9 embriona sa svake ploče stavljeno je na agar medij koji sadrži naznačene koncentracije KAND ili DMSO i inkubirano u komori za rast 14 dana.
Koristite sadnice obojene sa 5 mg/ml propidijum jodida (PI) da vizualizujete organizaciju meristema korena.PI signali su posmatrani fluorescentnom mikroskopom koristeći TCS SPE konfokalni laserski skenirajući mikroskop (Leica Microsystems).
Histohemijsko bojenje korijena β-glukuronidazom (GUS) izvedeno je prema protokolu koji su opisali Malami i Benfey36.Sadnice su fiksirane u 90% acetonu preko noći, obojene sa 0,5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-glukuronske kiseline u GUS puferu 1 sat i stavljene u hidratizirani rastvor hloraldehida.(8 g hloral hidrata, 2 ml vode i 1 ml glicerola) i posmatrano diferencijalnom interferentnom kontrastnom mikroskopom pomoću mikroskopa Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Uglovi korijena mjereni su na sadnicama starim 7 dana uzgojenim na vertikalno postavljenim pločama.Izmjerite ugao korijena iz smjera vektora gravitacije kao što je opisano u koraku 6.
Raspored kortikalnih mikrotubula je posmatran kako je opisano, sa manjim modifikacijama protokola 37 .Anti-β-tubulinsko antitijelo (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) i Alexa Fluor 488-konjugirani antimišji IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) korišteni su kao primarna i sekundarna antitijela u razrjeđenjima 1:1000 i 1:100 respektivno.Fluorescentne slike su dobijene upotrebom TCS SPE konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa (Leica Microsystems).Nabavite Z-stack slike i kreirajte projekcije maksimalnog intenziteta prema uputama proizvođača.
HeLa test proliferacije ćelija je izveden korišćenjem Cell Counting Kit 8 (Dojindo) prema uputstvima proizvođača.
Rast E. coli DH5α analiziran je mjerenjem gustine ćelija u kulturi pomoću spektrofotometra na 600 nm (OD600).
Organizacija citoskeleta u transgenim BY-2 ćelijama posmatrana je pomoću fluorescentnog mikroskopa opremljenog CSU-X1 konfokalnim uređajem za skeniranje (Yokogawa) i sCMOS kamerom (Zyla, Andor Technology).Gustoća citoskeleta je procijenjena analizom slike, koja je kvantificirala postotak citoskeletnih piksela među citoplazmatskim pikselima na konfokalnim slikama koristeći ImageJ softver kao što je opisano38,39.
Da bi se otkrila ćelijska smrt u BY-2 ćelijama, alikvot ćelijske suspenzije je inkubiran sa 0,05% Evans blue tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi.Selektivno Evans plavo bojenje mrtvih ćelija ovisi o ekstruziji boje iz živih stanica intaktnom plazma membranom40.Obojene ćelije su posmatrane pomoću mikroskopa sa svijetlim poljem (BX53, Olympus).
HeLa ćelije su uzgajane u DMEM sa dodatkom 10% FBS u vlažnom inkubatoru na 37°C i 5% CO2.Ćelije su tretirane sa 100 μM KAND 11, kumamonaminom kiselinom 6, kumamonamidom 1, 100 ng/ml kolcemida (Gibco) ili 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) tokom 6 sati na 37°C.Ćelije su fiksirane sa MetOH 10 min, a zatim acetatom 5 min na sobnoj temperaturi.Fiksne ćelije su inkubirane sa primarnim antitelom na β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) razblaženim u 0,5% BSA/PBS tokom 2 sata, isprane 3 puta sa TBST, a zatim inkubirane sa Alexa Fluor kozjim antitelom.488 1 sat.– Mišji IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) i 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindola (DAPI) razrijeđen u 0,5% BSA/PBS.Nakon tri puta ispiranja sa TBST, obojene ćelije su uočene na Nikon Eclipse Ti-E invertovanom mikroskopu.Slike su snimljene hlađenom Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamerom koristeći MetaMorph softver (Molecular Devices).
Vrijeme objave: Jun-17-2024