Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu CSS podršku. Za najbolje rezultate, preporučujemo da koristite noviju verziju preglednika (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazujemo stranicu bez stiliziranja ili JavaScripta.
Otkriće i korisna upotreba prirodnih proizvoda mogu pomoći u poboljšanju ljudskog života. Hemikalije koje inhibiraju rast biljaka široko se koriste kao herbicidi za suzbijanje korova. Zbog potrebe za korištenjem različitih vrsta herbicida, postoji potreba za identifikacijom spojeva s novim mehanizmima djelovanja. U ovoj studiji otkrili smo novi N-alkoksipirolni spoj, kumamonamid, iz Streptomyces werraensis MK493-CF1 i uspostavili kompletan proces sinteze. Putem testova biološke aktivnosti otkrili smo da je urs-monoaminska kiselina sintetički međuprodukt urs-monoamida i potencijalni...inhibitor rasta biljakaPored toga, razvili smo različite derivate urbenonske kiseline, uključujući urbeniloksi derivat (UDA), koji ima visoku herbicidnu aktivnost bez negativnog utjecaja na rast HeLa ćelija. Također smo otkrili da derivati urmotonske kiseline oštećuju biljne mikrotubule; osim toga, KAND utječe na aktinske filamente i izaziva ćelijsku smrt; Ovi višestruki efekti razlikuju se od onih poznatih inhibitora mikrotubula i ukazuju na novi mehanizam djelovanja ursonske kiseline, što predstavlja važnu prednost u razvoju novih herbicida.
Otkriće i praktična primjena korisnih prirodnih proizvoda i njihovih derivata sredstvo je za poboljšanje kvalitete ljudskog života. Sekundarni metaboliti koje proizvode mikroorganizmi, biljke i insekti doveli su do velikog napretka u medicini i poljoprivredi. Mnogi antibiotici i lijekovi protiv leukemije razvijeni su iz prirodnih proizvoda. Osim toga, razne vrstepesticidi, fungicidi i herbicidi se ekstrahuju iz ovih prirodnih proizvoda za upotrebu u poljoprivredi. Konkretno, herbicidi za suzbijanje korova su važni alati za povećanje prinosa usjeva u modernoj poljoprivredi, a različite vrste spojeva se već komercijalno koriste. Nekoliko ćelijskih procesa u biljkama, kao što su fotosinteza, metabolizam aminokiselina, sinteza ćelijskog zida, regulacija mitoze, signalizacija fitohormona ili sinteza proteina, smatraju se tipičnim metama herbicida. Spojevi koji inhibiraju funkciju mikrotubula su uobičajena klasa herbicida koji utiču na rast biljaka utičući na mitotičku regulaciju2.
Mikrotubule su komponente citoskeleta i široko su očuvane u eukariotskim ćelijama. Heterodimer tubulina sastoji se od α-tubulina i β-tubulina koji formiraju linearne protofilamente mikrotubula, sa 13 protofilamenata koji formiraju cilindričnu strukturu. Mikrotubule igraju višestruke uloge u biljnim ćelijama, uključujući određivanje oblika ćelije, ćelijske diobe i intracelularnog transporta3,4. Biljne ćelije sadrže mikrotubule ispod interfazne plazma membrane, a smatra se da ove takozvane kortikalne mikrotubule kontrolišu organizaciju celuloznih mikrofibrila putem regulacije kompleksa celulozne sintaze4,5. Kortikalne mikrotubule ćelija epiderme korijena, prisutne u zoni brzog izduživanja vrha korijena, nalaze se lateralno, a celulozna mikrofibrila prate ove mikrotubule i ograničavaju smjer širenja ćelija, čime se promovira anizotropno izduživanje ćelija. Stoga je funkcija mikrotubula usko povezana s morfologijom biljaka. Supstitucije aminokiselina u genima koji kodiraju tubulin uzrokuju iskrivljenje nizova kortikalnih mikrotubula i rast na lijevoj ili desnoj strani kod Arabidopsis 6,7. Slično tome, mutacije u proteinima povezanim s mikrotubulama koji regulišu dinamiku mikrotubula također mogu dovesti do iskrivljenog rasta korijena8,9,10,11,12,13. Osim toga, tretman herbicidima koji oštećuju mikrotubule, kao što je dizopiramid, poznat i kao pretilaklor, također uzrokuje rast korijena u lijevoj strani14. Ovi podaci ukazuju na to da je precizna regulacija funkcije mikrotubula ključna za određivanje smjera rasta biljaka.
Otkrivene su različite vrste inhibitora mikrotubula, a ovi lijekovi su dali značajan doprinos istraživanjima citoskeleta, kao i poljoprivredi i medicini2. Posebno, orizalin, dinitroanilinska jedinjenja, dizopiramid, jedinjenja srodna benzamidu i njihovi analozi mogu inhibirati funkciju mikrotubula i time inhibirati rast biljaka. Stoga se široko koriste kao herbicidi. Međutim, budući da su mikrotubule važna komponenta biljnih i životinjskih ćelija, većina inhibitora mikrotubula je citotoksična za oba tipa ćelija. Stoga, uprkos njihovoj prepoznatoj korisnosti kao herbicida, ograničen broj antimikrotubularnih sredstava se koristi u praktične svrhe.
Streptomyces je rod porodice Streptomyces, koja uključuje aerobne, gram-pozitivne, filamentozne bakterije i široko je poznata po svojoj sposobnosti proizvodnje širokog spektra sekundarnih metabolita. Stoga se smatra jednim od najvažnijih izvora novih biološki aktivnih prirodnih proizvoda. U trenutnoj studiji otkrili smo novi spoj nazvan kumamonamid, koji je izoliran iz Streptomyces werraensis MK493-CF1 i S. werraensis ISP 5486. Korištenjem spektralne analize i potpune spektralne analize, okarakterizirana je struktura kumamonamida i određen je njegov jedinstveni N-alkoksipirolni skelet. Utvrđeno je da ursmonska kiselina, sintetički međuprodukt ursmonoamida i njegovih derivata, inhibira rast i klijanje popularne modelne biljke Arabidopsis thaliana. U studiji odnosa strukture i aktivnosti, otkrili smo da spoj sa C9 modificiranim u ursonsku kiselinu, nazvan noniloksi derivat ursonske kiseline (KAND), značajno pojačava inhibitorni učinak na rast i klijanje. Značajno je da je novootkriveni inhibitor rasta biljaka također utjecao na rast duhana i jetrenjače, a nije bio citotoksičan za bakterije ili HeLa ćelije. Štaviše, neki derivati urmotonske kiseline induciraju iskrivljeni fenotip korijena, što implicira da ovi derivati direktno ili indirektno utječu na mikrotubule. U skladu s ovom idejom, naša zapažanja mikrotubula obilježenih imunohistokemijski ili fluorescentnim proteinima ukazuju na to da KAND tretman depolimerizira mikrotubule. Osim toga, tretman derivatima kumamotonske kiseline poremetio je aktinske mikrofilamente. Stoga smo otkrili novi inhibitor rasta biljaka čiji jedinstveni mehanizam djelovanja uključuje uništavanje citoskeleta.
Soj MK493-CF1 je izolovan iz tla u Shinagawa-ku, Tokio. Soj MK493-CF1 je formirao dobro razgranati stromalni micelijum. Određena je parcijalna sekvenca 16S ribosomskog RNA gena (1422 bp). Ovaj soj je veoma sličan S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipičan soj, 99,93%). Na osnovu ovog rezultata, utvrđeno je da je ovaj soj blisko povezan sa tipskim sojem S. werraensis. Stoga smo ovaj soj privremeno nazvali S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T takođe proizvodi iste bioaktivne spojeve. Budući da je u ranoj fazi bilo malo istraživanja o dobijanju prirodnih proizvoda iz ovog mikroorganizma, sprovedena su dalja hemijska istraživanja. Nakon kultivacije S. werraensis MK493-CF1 na ječmenom mediju fermentacijom u čvrstom stanju na 30°C tokom 14 dana, medij je ekstrahiran sa 50% EtOH. 60 ml uzorka je osušeno da bi se dobilo 59,5 mg sirovog ekstrakta. Sirovi ekstrakt je podvrgnut HPLC-u reverzne faze da bi se dobio N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid (1, nazvan kumamonamid, 36,0 mg). Ukupna količina 1 je približno 60% sirovog ekstrakta. Stoga smo odlučili detaljno proučiti svojstva kumamotoamida 1.
Kumamonamid 1 je bijeli amorfni prah, a masena spektrometrija visoke rezolucije (HRESIMS) potvrđuje C6H8N2O2 (Sl. 1). C2-supstituirani pirolni fragment ovog spoja karakteriziran je sa δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH u 1H NMR spektru: 4,5 Hz, H-5) i δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), a 13C NMR spektar pokazuje prisustvo četiri sp2 atoma ugljika. Prisustvo amidne grupe na C2 poziciji procijenjeno je HMBC korelacijom od C-3 protona do amidnog karbonilnog ugljika pri δC 161,1. Pored toga, 1H i 13C NMR vrhovi na δH 4,10 (3H, S) i δC 68,3 ukazuju na prisustvo N-metoksi grupa u molekulu. Iako tačan položaj metoksi grupe još nije bio određen spektroskopskom analizom kao što je spektroskopija poboljšane razlike i nuklearna Overhauser skraćenica (NOEDF), N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid je postao prvi kandidat za ovo jedinjenje.
Da bi se odredila ispravna struktura 1, izvršena je totalna sinteza (Sl. 2a). Tretman komercijalno dostupnog 2-aminopiridina 2 sa m-CPBA rezultirao je odgovarajućim N-oksidom 3 u kvantitativnom prinosu. Nakon 2-aminoazidacije 2, reakcija ciklokondenzacije koju je opisao Abramovich provedena je u benzenu na 90°C da bi se dobio željeni 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 u gramima. Brzina 60% (dvije faze). 15,16. Metilacija i hidroliza 4 zatim su dale 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilnu kiselinu (nazvanu "kumotonska kiselina", 6) u dobrom prinosu (70%, dva koraka). Konačno, amidacija putem međuprodukta kiselog hlorida 6 korištenjem vodenog amonijaka dala je Kumamoto amid 1 u prinosu od 98%. Svi spektralni podaci sintetiziranog 1 bili su slični izoliranom 1, tako da je određena struktura 1;
Opšta sinteza i analiza biološke aktivnosti urbenamida i urbenske kiseline. (a) Ukupna sinteza Kumamoto amida. (b) Sedmodnevne sadnice divljeg tipa Arabidopsis Columbia (Col) uzgajane su na Murashige i Skoog (MS) pločama koje su sadržavale kumamonamid 6 ili kumamonamid 1 u naznačenim koncentracijama. Mjerna skala = 1 cm.
Prvo smo procijenili biološke aktivnosti urbenamida i njegovih međuprodukata u pogledu njihove sposobnosti moduliranja rasta biljaka. Dodali smo različite koncentracije ursmonamida 1 ili ursmonske kiseline 6 u MS agar medij i uzgajali sadnice Arabidopsis thaliana na ovom mediju. Ovi testovi su pokazali da visoke koncentracije (500 μM) 6 inhibiraju rast korijena (Sl. 2b). Zatim smo generirali različite derivate zamjenom N1 pozicije 6 i proveli studije odnosa strukture i aktivnosti na njima (proces sinteze analoga opisan je u Dodatnim informacijama (SI)). Sadnice Arabidopsis uzgajane su na mediju koji sadrži 50 μM derivata ursonske kiseline, a dužina korijena je izmjerena kao što je prikazano na slici. Kao što je prikazano na slikama 3a, b i S1, kumamo kiseline imaju različite dužine linearnih alkoksilnih lanaca (9, 10, 11, 12 i 13) ili velikih alkoksilnih lanaca (15, 16 i 17) na N1 poziciji. Derivati su pokazali značajnu inhibiciju rasta korijena. Osim toga, otkrili smo da primjena 200 μM 10, 11 ili 17 inhibira klijanje (Slike 3c i S2).
Proučavanje odnosa strukture i aktivnosti Kumamoto amida i srodnih spojeva. (a) Struktura i shema sinteze analoga. (b) Kvantifikacija dužine korijena 7 dana starih sadnica uzgojenih na MS podlozi sa ili bez 50 μM derivata kumamonamida. Zvjezdice označavaju značajne razlike u odnosu na lažni tretman (t-test, p< 0,05). n>18. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD. nt znači „nije testirano“ jer više od 50% sjemena nije proklijalo. (c) Kvantifikacija stope klijanja tretiranog sjemena inkubiranog 7 dana u MS medijumu sa ili bez 200 μM kumamonamida i srodnih jedinjenja. Zvjezdice označavaju značajne razlike u odnosu na lažni tretman (hi-kvadrat test). n=96.
Zanimljivo je da je dodavanje alkilnih bočnih lanaca dužih od C9 smanjilo inhibitornu aktivnost, što ukazuje na to da spojevi srodni kumamotoičnoj kiselini zahtijevaju bočne lance određene veličine da bi pokazali svoju biološku aktivnost.
Budući da je analiza odnosa strukture i aktivnosti pokazala da je C9 modificiran u ursonsku kiselinu i da je noniloksi derivat ursonske kiseline (u daljnjem tekstu KAND 11) bio najefikasniji inhibitor rasta biljaka, proveli smo detaljniju karakterizaciju KAND 11. Tretman Arabidopsis sa 50 μM KAND 11 gotovo je u potpunosti spriječio klijanje, dok su niže koncentracije (40, 30, 20 ili 10 μM) KAND 11 inhibirale rast korijena na način koji ovisi o dozi (slika 4a, b). Da bismo testirali da li KAND 11 utiče na održivost meristema korijena, ispitali smo meristeme korijena obojene propidijum jodidom (PI) i izmjerili veličinu površine meristema. Veličina meristema sadnica uzgojenih na medijumu koji sadrži 25 μM KAND-11 iznosila je 151,1 ± 32,5 μm, dok je veličina meristema sadnica uzgojenih na kontrolnom medijumu koji sadrži DMSO iznosila 264,7 ± 30,8 μm (Slika 4c, d), što ukazuje da KAND-11 obnavlja ćelijsku aktivnost. širenje. Korijen meristem. U skladu s tim, tretman KAND-11 smanjio je količinu signala markera ćelijske diobe CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS u korijenovom meristemu (Slika 4e) 17. Ovi rezultati ukazuju na to da KAND 11 inhibira rast korijena smanjenjem aktivnosti proliferacije ćelija.
Analiza inhibitornog efekta derivata urbenonske kiseline (urbeniloksi derivata) na rast. (a) Sadnice divljeg tipa Col stare 7 dana uzgojene na MS pločama sa naznačenim koncentracijama KAND 11. Mjerna skala = 1 cm. (b) Kvantifikacija dužine korijena. Slova označavaju značajne razlike (Tukey HSD test, p< 0,05). n>16. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD. (c) Konfokalna mikroskopija korijena divljeg tipa Col obojenog propidijum jodidom, uzgojenog na MS pločama sa ili bez 25 μM KAND 11. Bijele zagrade označavaju meristem korijena. Mjerna skala = 100 µm. (d) Kvantifikacija veličine meristema korijena (n = 10 do 11). Statističke razlike su određene t-testom (p< 0,05). Trake predstavljaju prosječnu veličinu meristema. (e) Mikroskopija diferencijalnog interferentnog kontrasta (DIC) korijenskog meristema koji sadrži CDKB2 konstrukt; 1pro: CDKB2; 1-GUS obojeno i obojeno na 5 dana starim sadnicama uzgojenim na MS pločama sa ili bez 25 µM KAND testa.
Fitotoksičnost KAND-a 11 dodatno je testirana korištenjem druge dikotiledone biljke, duhana (Nicotiana tabacum) i glavnog modelnog organizma kopnene biljke, jetrenjače (Marchantia polymorpha). Kao i u slučaju Arabidopsis, sadnice duhana SR-1 uzgojene na podlozi koja sadrži 25 μM KAND-a 11 proizvele su kraće korijenje (Slika 5a). Osim toga, 40 od 48 sjemenki proklijalo je na pločama koje su sadržavale 200 μM KAND-a 11, dok je svih 48 sjemenki proklijalo na lažno tretiranoj podlozi, što ukazuje na to da su veće koncentracije KAND-a bile značajne (p< 0,05; hi test - kvadrat) inhibirao je klijanje duhana. (Sl. 5b). Osim toga, koncentracija KAND 11 koja je inhibirala rast bakterija u jetrenjači bila je slična efektivnoj koncentraciji u Arabidopsisu (Sl. 5c). Ovi rezultati ukazuju na to da KAND 11 može inhibirati rast raznih biljaka. Zatim smo istražili moguću citotoksičnost spojeva povezanih s monoamidima medvjeda u drugim organizmima, naime ljudskim HeLa ćelijama i soju Escherichia coli DH5α, kao predstavnicima viših životinjskih i bakterijskih ćelija. U nizu testova proliferacije ćelija, uočili smo da kumamonamid 1, kumamonamidna kiselina 6 i KAND 11 nisu utjecali na rast HeLa ili E. coli ćelija pri koncentracijama od 100 μM (Sl. 5d,e).
Inhibicija rasta KAND 11 kod organizama koji nisu Arabidopsis. (a) Dvonedeljne sadnice duhana divljeg tipa SR-1 uzgajane su na vertikalno postavljenim MS pločama koje su sadržavale 25 μM KAND 11. (b) Dvonedeljne sadnice duhana divljeg tipa SR-1 uzgajane su na horizontalno postavljenim MS pločama koje su sadržavale 200 μM KAND 11. (c) Dvonedeljni pupoljci jetrenjače divljeg tipa Tak-1 uzgajani na Gamborg B5 pločama sa naznačenim koncentracijama KAND 11. Crvene strelice označavaju spore koje su prestale da rastu unutar dvonedeljnog perioda inkubacije. (d) Test proliferacije ćelija HeLa. Broj održivih ćelija mjeren je u fiksnim vremenskim intervalima pomoću kompleta za brojanje ćelija 8 (Dojindo). Kao kontrola, HeLa ćelije su tretirane sa 5 μg/ml aktinomicina D (Act D), koji inhibira transkripciju RNK polimeraze i uzrokuje smrt ćelija. Analize su izvršene u tri ponavljanja. (e) Test proliferacije ćelija E. coli. Rast E. coli analiziran je mjerenjem OD600. Kao kontrola, ćelije su tretirane sa 50 μg/ml ampicilina (Amp), koji inhibira sintezu ćelijskog zida bakterija. Analize su provedene u tri ponavljanja.
Kako bismo dešifrirali mehanizam djelovanja citotoksičnosti uzrokovane spojevima srodnim uramidu, ponovo smo analizirali derivate urbenske kiseline s umjerenim inhibitornim efektima, kao što je prikazano na slici. Kao što je prikazano na slikama 2b i 6a, sadnice uzgojene na agar pločama koje sadrže visoke koncentracije (200 μM) urmotonske kiseline 6 proizvele su kraće i lijevo zakrivljeno korijenje (θ = – 23,7 ± 6,1), dok su sadnice uzgojene na kontrolnom mediju proizvele gotovo ravno korijenje (θ = – 3,8 ± 7,1). Poznato je da ovaj karakteristični kosi rast rezultat je disfunkcije kortikalnih mikrotubula14,18. U skladu s ovim nalazom, lijekovi koji destabiliziraju mikrotubule, dizopiramid i orizalin, izazvali su slično naginjanje korijena pod našim uvjetima rasta (slike 2b i 6a). Istovremeno, testirali smo derivate urmotonske kiseline i odabrali nekoliko njih koji su, pri određenim koncentracijama, izazvali kosi rast korijena. Spojevi 8, 9 i 15 promijenili su smjer rasta korijena pri 75 μM, 50 μM i 40 μM, respektivno, što ukazuje na to da ovi spojevi mogu efikasno destabilizirati mikrotubule (Slika 2b, 6a). Također smo testirali najpotentniji derivat ursolne kiseline, KAND 11, pri nižoj koncentraciji (15 µM) i otkrili da primjena KAND 11 inhibira rast korijena i da je smjer rasta korijena neujednačen, iako ima tendenciju nagiba ulijevo (Slika C3). Budući da veće koncentracije lijekova koji destabiliziraju mikrotubule ponekad inhibiraju rast biljaka, a ne uzrokuju naginjanje korijena, naknadno smo procijenili mogućnost da KAND 11 utječe na mikrotubule promatrajući kortikalne mikrotubule u epidermalnim ćelijama korijena. Imunohistohemija korištenjem anti-β-tubulin antitijela u epidermalnim ćelijama korijena sadnica tretiranih sa 25 μM KAND 11 pokazala je nestanak gotovo svih kortikalnih mikrotubula u epidermalnim ćelijama u zoni elongacije (Slika 6b). Ovi rezultati ukazuju na to da kumamotonska kiselina i njeni derivati djeluju direktno ili indirektno na mikrotubule kako bi ih poremetili i da su ovi spojevi novi inhibitori mikrotubula.
Ursonska kiselina i njeni derivati mijenjaju kortikalne mikrotubule kod Arabidopsis thaliana. (a) Ugao nagiba korijena mjeren u prisustvu različitih derivata urmotonske kiseline u naznačenim koncentracijama. Analizirani su i efekti dva spoja za koja se zna da inhibiraju mikrotubule: dizopiramid i orizalin. Umetak prikazuje standard koji se koristi za mjerenje ugla rasta korijena. Zvjezdice označavaju značajne razlike u odnosu na lažni tretman (t-test, p< 0,05). n>19. Mjerna skala = 1 cm. (b) Kortikalne mikrotubule u epidermalnim ćelijama u zoni elongacije. Mikrotubule u korijenu divljeg tipa Arabidopsis Col uzgojenom na MS pločama sa ili bez 25 μM KAND 11 vizualizirane su imunohistokemijskim bojenjem korištenjem primarnih antitijela na β-tubulin i sekundarnih antitijela konjugiranih s Alexa Fluorom. Mjerna skala = 10 µm. (c) Mitotička struktura mikrotubula u meristemu korijena. Mikrotubule su vizualizirane imunohistokemijskim bojenjem. Mitotičke strukture, uključujući profazne zone, vretena i fragmoplaste, prebrojane su iz konfokalnih slika. Strelice označavaju mitotičke strukture mikrotubula. Zvjezdice označavaju značajne razlike u odnosu na lažni tretman (t-test, p< 0,05). n>9. Mjerna traka = 50 µm.
Iako Ursa ima sposobnost da poremeti funkciju mikrotubula, očekuje se da će njen mehanizam djelovanja biti drugačiji od tipičnih sredstava za depolimerizaciju mikrotubula. Na primjer, veće koncentracije sredstava za depolimerizaciju mikrotubula, kao što su dizopiramid i orizalin, indukuju anizotropnu ekspanziju epidermalnih ćelija, dok KAND 11 to ne čini. Osim toga, istovremena primjena KAND 11 i dizopiramida rezultirala je kombinovanim odgovorom rasta korijena indukovanim dizopiramidom, a uočena je i inhibicija rasta indukovana KAND 11 (slika S4). Također smo analizirali odgovor preosjetljivog mutanta dizopiramid 1-1 (phs1-1) na KAND 11. phs1-1 ima nekanonsku tačkastu mutaciju tubulin kinaze i proizvodi kraće korijenje kada se tretira dizopiramidom9,20. Sadnice mutanta phs1-1 uzgojene na agar medijumu koji sadrži KAND 11 imale su kraće korijenje slično onima uzgojenim na dizopiramidu (slika S5).
Osim toga, uočili smo mitotičke strukture mikrotubula, kao što su profazne zone, vretena i fragmoplasti, u korijenovom meristemu sadnica tretiranih sa KAND 11. U skladu sa zapažanjima za CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, uočeno je značajno smanjenje broja mitotičkih mikrotubula (Sl. .6c).
Da bismo okarakterizirali citotoksičnost KAND 11 pri subcelularnoj rezoluciji, tretirali smo suspenzijske ćelije duhana BY-2 sa KAND 11 i posmatrali njihov odgovor. Prvo smo dodali KAND 11 BY-2 ćelijama koje eksprimiraju TagRFP-TUA6, koji fluorescentno označava mikrotubule, kako bismo procijenili učinak KAND 11 na kortikalne mikrotubule. Gustina kortikalnih mikrotubula procijenjena je analizom slike, koja je kvantificirala postotak citoskeletnih piksela među citoplazmatskim pikselima. Rezultati testa pokazali su da se nakon tretmana sa 50 μM ili 100 μM KAND 11 tokom 1 sata, gustoća značajno smanjila na 0,94 ± 0,74% odnosno 0,23 ± 0,28%, dok je gustoća ćelija tretiranih DMSO iznosila 1,61 ± 0,34% (Slika 7a). Ovi rezultati su u skladu sa zapažanjem kod Arabidopsis da tretman KAND 11 inducira depolimerizaciju kortikalnih mikrotubula (Slika 6b). Također smo ispitali BY-2 liniju sa GFP-ABD-obilježenim aktinskim filamentima nakon tretmana istom koncentracijom KAND 11 i uočili da tretman KAND 11 poremećuje aktinske filamente. Tretman sa 50 μM ili 100 μM KAND 11 tokom 1 sata značajno je smanjio gustinu aktinskih filamenata na 1,20 ± 0,62% odnosno 0,61 ± 0,26%, dok je gustina u ćelijama tretiranim DMSO bila 1,69 ± 0,51% (Slika 2). 7b). Ovi rezultati su u suprotnosti sa efektima propizamida, koji ne utiče na aktinske filamente, i latrunkulina B, depolimerizatora aktina koji ne utiče na mikrotubule (SI slika S6). Pored toga, tretman kumamonamidom 1, kumamonamidnom kiselinom 6 ili KAND 11 nije uticao na mikrotubule u HeLa ćelijama (SI slika S7). Stoga se vjeruje da je mehanizam djelovanja KAND 11 drugačiji od mehanizma poznatih disruptora citoskeleta. Osim toga, naše mikroskopsko posmatranje BY-2 ćelija tretiranih KAND 11 otkrilo je početak ćelijske smrti tokom tretmana KAND 11 i pokazalo da se udio mrtvih ćelija obojenih Evans plavom bojom nije značajno povećao nakon 30 minuta tretmana KAND 11, dok se nakon 90 minuta tretmana sa 50 μM ili 100 μM KAND-a broj mrtvih ćelija povećao na 43,7% odnosno 80,1% (Slika 7c). Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju na to da je novi derivat ursolne kiseline KAND 11 biljni inhibitor citoskeleta sa prethodno nepoznatim mehanizmom djelovanja.
KAND utiče na kortikalne mikrotubule, aktinske filamente i održivost BY-2 ćelija duhana. (a) Vizualizacija kortikalnih mikrotubula u BY-2 ćelijama u prisustvu TagRFP-TUA6. BY-2 ćelije tretirane sa KAND 11 (50 μM ili 100 μM) ili DMSO ispitane su konfokalnom mikroskopijom. Gustina kortikalnih mikrotubula izračunata je iz mikrografija 25 nezavisnih ćelija. Slova označavaju značajne razlike (Tukey HSD test, p< 0,05). Mjerna traka = 10 µm. (b) Kortikalni aktinski filamenti u BY-2 ćelijama vizualizirani u prisustvu GFP-ABD2. BY-2 ćelije tretirane sa KAND 11 (50 μM ili 100 μM) ili DMSO ispitane su konfokalnom mikroskopijom. Gustina kortikalnih aktinskih filamenata izračunata je iz mikrografija 25 nezavisnih ćelija. Slova označavaju značajne razlike (Tukey HSD test, p< 0,05). Mjerna skala = 10 µm. (c) Posmatranje mrtvih BY-2 ćelija bojenjem Evans plavim. BY-2 ćelije tretirane sa KAND 11 (50 μM ili 100 μM) ili DMSO su pregledane mikroskopijom svijetlog polja. n=3. Mjerna skala = 100 µm.
Otkriće i primjena novih prirodnih proizvoda doveli su do značajnog napretka u različitim aspektima ljudskog života, uključujući medicinu i poljoprivredu. Provedena su historijska istraživanja kako bi se dobili korisni spojevi iz prirodnih resursa. Posebno su poznati aktinomiceti kao korisni antiparazitski antibiotici za nematode zbog svoje sposobnosti da proizvode različite sekundarne metabolite poput avermektina, vodećeg spoja ivermektina i bleomicina i njegovih derivata, koji se medicinski koriste kao sredstvo protiv raka21,22. Slično tome, otkriveni su razni herbicidni spojevi iz aktinomiceta, od kojih se neki već komercijalno koriste1,23. Stoga se analiza metabolita aktinomiceta radi izolacije prirodnih proizvoda sa željenim biološkim aktivnostima smatra efikasnom strategijom. U ovoj studiji otkrili smo novi spoj, kumamonamid, iz S. werraensis i uspješno ga sintetizirali. Ursonska kiselina je sintetički međuprodukt urbenamida i njegovih derivata. Može uzrokovati karakteristično uvijanje korijena, pokazivati umjerenu do jaku herbicidnu aktivnost i direktno ili indirektno oštetiti biljne mikrotubule. Međutim, mehanizam djelovanja urmotonske kiseline može se razlikovati od mehanizma djelovanja postojećih inhibitora mikrotubula, budući da KAND 11 također remeti aktinske filamente i uzrokuje ćelijsku smrt, što ukazuje na regulatorni mehanizam kojim urmotonska kiselina i njeni derivati utiču na širok spektar citoskeletnih struktura.
Dalja detaljna karakterizacija urbenonske kiseline pomoći će u boljem razumijevanju mehanizma djelovanja urbenonske kiseline. Konkretno, sljedeći cilj je procijeniti sposobnost ursonske kiseline da se veže za reducirane mikrotubule kako bi se utvrdilo da li ursonska kiselina i njeni derivati djeluju direktno na mikrotubule i depolimeriziraju ih ili njihovo djelovanje rezultira destabilizacijom mikrotubula. Osim toga, u slučaju kada mikrotubule nisu direktna meta, identifikacija mjesta djelovanja i molekularnih ciljeva ursonske kiseline na biljnim ćelijama pomoći će u daljem razumijevanju svojstava srodnih spojeva i mogućih načina za poboljšanje herbicidne aktivnosti. Naš test bioaktivnosti otkrio je jedinstvenu citotoksičnu sposobnost ursonske kiseline na rast biljaka kao što su Arabidopsis thaliana, duhan i jetrenjača, dok ni E. coli ni HeLa ćelije nisu bile pogođene. Mala ili nikakva toksičnost za životinjske ćelije je prednost derivata ursonske kiseline ako se razviju kao herbicidi za upotrebu na otvorenim poljoprivrednim poljima. Zaista, budući da su mikrotubule uobičajene strukture kod eukariota, njihova selektivna inhibicija u biljkama je ključni zahtjev za herbicide. Na primjer, propizamid, sredstvo za depolimerizaciju mikrotubula koje se direktno veže za tubulin i inhibira polimerizaciju, koristi se kao herbicid zbog svoje niske toksičnosti za životinjske ćelije24. Za razliku od dizopiramida, srodni benzamidi imaju različite specifičnosti djelovanja na ciljne ćelije. Pored biljnih mikrotubula, RH-4032 ili benzoksamid također inhibira mikrotubule životinjskih ćelija, odnosno oomiceta, a zalilamid se koristi kao fungicid zbog svoje niske fitotoksičnosti25,26,27. Novootkriveni medvjed i njegovi derivati pokazuju selektivnu citotoksičnost protiv biljaka, ali vrijedi napomenuti da daljnje modifikacije mogu promijeniti njihovu specifičnost djelovanja na ciljne ćelije, potencijalno pružajući dodatne derivate za kontrolu patogenih gljivica ili oomiceta.
Jedinstvena svojstva urbenonske kiseline i njenih derivata korisna su za njihov razvoj kao herbicida i upotrebu kao istraživačkih alata. Važnost citoskeleta u kontroli oblika biljnih ćelija je široko prepoznata. Ranije studije su pokazale da su biljke razvile složene mehanizme organizacije kortikalnih mikrotubula kontrolirajući dinamiku mikrotubula kako bi pravilno kontrolirale morfogenezu. Identificiran je veliki broj molekula odgovornih za regulaciju aktivnosti mikrotubula, a srodna istraživanja su još uvijek u toku3,4,28. Naše trenutno razumijevanje dinamike mikrotubula u biljnim ćelijama ne objašnjava u potpunosti mehanizme organizacije kortikalnih mikrotubula. Na primjer, iako i dizopiramid i orizalin mogu depolimerizirati mikrotubule, dizopiramid uzrokuje ozbiljno izobličenje korijena, dok orizalin ima relativno blag učinak. Štaviše, mutacije u tubulinu, koji stabilizira mikrotubule, također uzrokuju dekstrorotaciju u korijenu, dok paklitaksel, koji također stabilizira dinamiku mikrotubula, to ne čini. Stoga bi proučavanje i identificiranje molekularnih ciljeva ursolne kiseline trebalo pružiti nove uvide u regulaciju biljnih kortikalnih mikrotubula. Slično tome, buduća poređenja hemikalija koje su efikasne u podsticanju iskrivljenog rasta, poput disopiramida, i manje efikasnih hemikalija, poput orizalina ili kumamotorne kiseline, pružit će tragove o tome kako dolazi do iskrivljenog rasta.
S druge strane, preuređenja citoskeleta povezana s odbranom su još jedna mogućnost za objašnjenje citotoksičnosti ursonske kiseline. Infekcija patogenom ili unošenje elicitora u biljne ćelije ponekad uzrokuje uništavanje citoskeleta i naknadnu smrt ćelija29. Na primjer, zabilježeno je da kriptoksantin izveden iz oomiceta remeti mikrotubule i aktinske filamente prije smrti ćelija duhana, slično onome što se događa kod KAND tretmana30,31. Sličnosti između odbrambenih odgovora i ćelijskih odgovora izazvanih ursonskom kiselinom navele su nas na hipotezu da oni pokreću uobičajene ćelijske procese, iako je evidentan brži i jači učinak ursonske kiseline nego kriptoksantina. Međutim, studije su pokazale da poremećaj aktinskih filamenata potiče spontanu smrt ćelija, što nije uvijek praćeno poremećajem mikrotubula29. Osim toga, ostaje da se vidi da li patogen ili elicitor uzrokuju iskrivljeni rast korijena, kao što to čine derivati ursonske kiseline. Stoga je molekularno znanje koje povezuje odbrambene odgovore i citoskelet atraktivan problem koji treba riješiti. Iskorištavanjem prisustva spojeva niske molekularne težine srodnih ursonskoj kiselini, kao i niza derivata s različitim potencijalima, oni mogu pružiti mogućnosti za ciljanje nepoznatih ćelijskih mehanizama.
Uzevši sve u obzir, otkriće i primjena novih spojeva koji moduliraju dinamiku mikrotubula pružit će moćne metode za rješavanje složenih molekularnih mehanizama koji leže u osnovi određivanja oblika biljnih ćelija. U tom kontekstu, nedavno razvijeni spoj urmotonska kiselina, koja utječe na mikrotubule i aktinske filamente te izaziva ćelijsku smrt, može pružiti priliku za dešifriranje veze između kontrole mikrotubula i ovih drugih mehanizama. Stoga će nam hemijska i biološka analiza korištenjem urbenonske kiseline pomoći da razumijemo molekularne regulatorne mehanizme koji kontroliraju biljni citoskelet.
Inokulirajte S. werraensis MK493-CF1 u Erlenmeyerovu tikvicu od 500 mL sa pregradom koja sadrži 110 mL sjemenskog medija koji se sastoji od 2% (w/v) galaktoze, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) Bacto soytona (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) ekstrakta kukuruza (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 i 0,2% CaCO3 u deioniziranoj vodi. (pH 7,4 prije sterilizacije). Sjemenske kulture su inkubirane na rotacijskoj mućkalici (180 rpm) na 27°C tokom 2 dana. Proizvodni uzgoj putem fermentacije na čvrstom stanju. Sjemenska kultura (7 ml) je prebačena u K-1 tikvicu od 500 ml koja sadrži 40 g produkcijskog medija koji se sastoji od 15 g prešanog ječma (MUSO Co., Ltd., Japan) i 25 g deionizirane vode (pH nije podešen prije sterilizacije). Fermentacija je provedena na 30°C u mraku tokom 14 dana. Fermentacijski materijal je ekstrahiran sa 40 ml/boca EtOH i centrifugiran (1500 g, 4°C, 10 min). Supernatant kulture (60 ml) je ekstrahiran smjesom 10% MeOH/EtOAc. Organski sloj je uparen pod smanjenim pritiskom da bi se dobio ostatak (59,5 mg), koji je podvrgnut HPLC-u sa gradijentnom elucijom (0–10 minuta: 90%) na koloni reverzne faze (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × dužina 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuta: 90% H2O/CH3CN do 70% H2O/CH3CN (gradijent), 35–45 minuta: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuta: 90% H2O/EtOH do 100% EtOH (gradijent (gradijent), 155–200 min: 100% EtOH) pri brzini protoka od 1,5 ml/min, kumamonamid (1, 36,0 mg) je izolovan kao bijeli amorfni prah.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ izračunata vrijednost: 141,0659, izmjerena vrijednost: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Sjeme Columbia (Col-0) nabavljeno je iz Centra za biološke resurse Arabidopsis (ABRC) uz dozvolu za istraživačku upotrebu. Sjeme Col-0 razmnoženo je i održavano u našim laboratorijskim uslovima i korišteno kao biljke divljeg tipa Arabidopsis. Sjeme Arabidopsis je površinski sterilizirano i kultivirano u Murashige i Skoog medijumu upola jačine koji sadrži 2% saharoze (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)etansulfonske kiseline (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical).) i 1,5% agara (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, na 23 °C i konstantnom svjetlu. Sjeme mutanta phs1-1 obezbijedio je T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Sjeme soja SR-1 obezbijedio je T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) i korišteno je kao divlji tip biljke duhana. Sjeme duhana je površinski sterilizirano i natopljeno sterilnom vodom tri noći kako bi se potaknulo klijanje, a zatim stavljeno u rastvor upola jače koncentracije koji sadrži 2% saharoze, 0,05% (w/v) MES-a i 0,8% gelan gume (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige i Skoog medij) sa pH 5,7 i inkubirano na 23°C pod konstantnim svjetlom.
Soj Tak-1 je obezbijedio T. Kohchi (Univerzitet u Kjotu) i korišten je kao standardna eksperimentalna jedinica za studiju jetrenjače. Gemma je dobijena iz steriliziranih kultiviranih biljaka, a zatim je zasađena na Gamborg B5 medij (Fujifilm Wako Pure Chemical) koji sadrži 1% saharoze i 0,3% gelan gume i inkubirana na 23°C pod kontinuiranim svjetlom.
Ćelije duhana BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) obezbijedio je S. Hasezawa (Univerzitet u Tokiju). BY-2 ćelije su razrijeđene 95 puta u modificiranom Linsmeier i Skoog mediju i sedmično dopunjavane 2,4-dihlorofenoksisirćetnom kiselinom 32. Suspenzija ćelija je miješana na rotacionoj mućkalici pri 130 rpm na 27°C u mraku. Ćelije su isprane sa 10 puta većom količinom svježeg medija i resuspendovane u istom mediju. Transgene ćelijske linije BY-2 koje stabilno eksprimiraju marker mikrotubula TagRFP-TUA6 ili marker aktinskih filamenata GFP-ABD2 pod promotorom 35S virusa mozaika karfiola generirane su kako je opisano 33,34,35. Ove ćelijske linije mogu se održavati i sinhronizovati korištenjem postupaka sličnih onima koji su korišteni za originalnu ćelijsku liniju BY-2.
HeLa ćelije su kultivirane u Dulbeccoovom modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) (Life Technologies) dopunjenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma, 1,2 U/ml penicilina i 1,2 μg/ml streptomicina u inkubatoru na 37°C sa 5% CO2.
Svi eksperimenti opisani u ovom rukopisu izvedeni su u skladu s japanskim propisima i smjernicama o biološkoj sigurnosti.
Spojevi su rastvoreni u dimetil sulfoksidu (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kao osnovni rastvori i razrijeđeni u MS mediju za Arabidopsis i duhan ili Gamborg B5 mediju za jetrenjaču. Za test inhibicije rasta korijena, više od 10 sjemenki po ploči posijano je na agarni medij koji sadrži naznačene spojeve ili DMSO. Sjeme je inkubirano u komori za rast 7 dana. Sadnice su fotografirane i izmjerena je dužina korijena. Za test klijanja Arabidopsis, 48 sjemenki po ploči posijano je na agarni medij koji sadrži 200 μM spoja ili DMSO. Sjeme Arabidopsis uzgajano je u komori za rast, a broj proklijalih sadnica prebrojan je 7 dana nakon klijanja (dag). Za test klijanja duhana, 24 sjemenke po ploči posijano je na agarni medij koji sadrži 200 μM KAND-a ili DMSO-a. Sjeme duhana uzgajano je u komori za rast, a broj proklijalih sadnica prebrojan je nakon 14 dana. Za test inhibicije rasta jetrenjače, 9 embrija iz svake ploče je nasađeno na agarni medij koji sadrži naznačene koncentracije KAND-a ili DMSO-a i inkubirano u komori za rast tokom 14 dana.
Za vizualizaciju organizacije meristema korijena korištene su sadnice obojene s 5 mg/ml propidijum jodida (PI). PI signali su uočeni fluorescentnom mikroskopijom korištenjem TCS SPE konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa (Leica Microsystems).
Histohemijsko bojenje korijena β-glukuronidazom (GUS) provedeno je prema protokolu koji su opisali Malami i Benfey36. Sadnice su fiksirane u 90% acetonu preko noći, obojene sa 0,5 mg/ml 5-bromo-4-hloro-3-indolil-β-d-glukuronske kiseline u GUS puferu tokom 1 sata i stavljene u hidratizirani rastvor hloraldehida (8 g hloral hidrata, 2 ml vode i 1 ml glicerola) i posmatrane diferencijalnom interferentnom kontrastnom mikroskopijom korištenjem Axio Imager M1 mikroskopa (Carl Zeiss).
Uglovi korijena su mjereni na 7 dana starim sadnicama uzgojenim na vertikalno postavljenim pločama. Izmjerite ugao korijena od smjera vektora gravitacije kao što je opisano u koraku 6.
Raspored kortikalnih mikrotubula je posmatran kako je opisano, uz manje izmjene protokola 37. Anti-β-tubulin antitijelo (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) i Alexa Fluor 488-konjugirani anti-mišji IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) su korišteni kao primarna i sekundarna antitijela u razrjeđenjima 1:1000 i 1:100, respektivno. Fluorescentne slike su dobijene korištenjem TCS SPE konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa (Leica Microsystems). Napravite Z-stack slike i kreirajte projekcije maksimalnog intenziteta prema uputama proizvođača.
Test proliferacije HeLa ćelija proveden je korištenjem Cell Counting Kit 8 (Dojindo) prema uputama proizvođača.
Rast E. coli DH5α analiziran je mjerenjem gustoće ćelija u kulturi pomoću spektrofotometra na 600 nm (OD600).
Organizacija citoskeleta u transgenim BY-2 ćelijama posmatrana je korištenjem fluorescentnog mikroskopa opremljenog CSU-X1 konfokalnim uređajem za skeniranje (Yokogawa) i sCMOS kamerom (Zyla, Andor Technology). Gustoća citoskeleta procijenjena je analizom slike, koja je kvantificirala postotak piksela citoskeleta među citoplazmatskim pikselima u konfokalnim slikama korištenjem ImageJ softvera kao što je opisano38,39.
Da bi se detektovala ćelijska smrt u BY-2 ćelijama, alikvot ćelijske suspenzije inkubiran je sa 0,05% Evans plavim tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Selektivno bojenje mrtvih ćelija Evans plavim zavisi od ekstruzije boje iz održivih ćelija putem intaktne plazma membrane40. Obojene ćelije su posmatrane pomoću mikroskopa sa svijetlim poljem (BX53, Olympus).
HeLa ćelije su uzgajane u DMEM-u dopunjenom sa 10% FBS u vlažnom inkubatoru na 37°C i 5% CO2. Ćelije su tretirane sa 100 μM KAND 11, kumamonamičnom kiselinom 6, kumamonamidom 1, 100 ng/ml kolcemida (Gibco) ili 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) tokom 6 sati na 37°C. Ćelije su fiksirane sa MetOH tokom 10 minuta, a zatim sa acetatom tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Fiksirane ćelije su inkubirane sa primarnim antitijelom β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) razrijeđenim u 0,5% BSA/PBS tokom 2 sata, isprane 3 puta sa TBST, a zatim inkubirane sa kozjim antitijelom Alexa Fluor. 488 1 sat. – Mišji IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) i 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindola (DAPI) razrijeđenog u 0,5% BSA/PBS. Nakon trostrukog ispiranja sa TBST-om, obojene ćelije su posmatrane na inverznom mikroskopu Nikon Eclipse Ti-E. Slike su snimljene ohlađenom Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamerom korištenjem MetaMorph softvera (Molecular Devices).
Vrijeme objave: 17. juni 2024.