Da bi se efikasnosuzbijanje komaracai smanjenje učestalosti bolesti koje prenose, potrebne su strateške, održive i ekološki prihvatljive alternative hemijskim pesticidima. Procijenili smo sjemensku sačmu određenih Brassicaceae (porodica Brassica) kao izvor izotiocijanata biljnog porijekla, proizvedenih enzimskom hidrolizom biološki neaktivnih glukozinolata za upotrebu u kontroli egipatske vrste Aedes (L., 1762). Petostruko odmašćena sjemenska sačma (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 i Thlaspi arvense – tri glavne vrste termičke inaktivacije i enzimske razgradnje. Hemijski proizvodi: Za određivanje toksičnosti (LC50) alil izotiocijanata, benzil izotiocijanata i 4-hidroksibenzilizotiocijanata za larve Aedes aegypti pri 24-satnoj izloženosti = 0,04 g/120 ml dH2O). LC50 vrijednosti za sjemenski brašno gorušice, bijele gorušice i preslice bile su 0,05, 0,08 i 0,05 respektivno u poređenju sa alil izotiocijanatom (LC50 = 19,35 ppm) i 4,2-hidroksibenzilizotiocijanat (LC50 = 55,41 ppm) bio je toksičniji za larve 24 sata nakon tretmana nego 0,1 g/120 ml dH2O respektivno. Ovi rezultati su u skladu s proizvodnjom sjemenskog brašna lucerne. Veća efikasnost benzil estera odgovara izračunatim LC50 vrijednostima. Korištenje sjemenskog brašna može pružiti efikasnu metodu suzbijanja komaraca. Istražuje se efikasnost praha sjemena krstašica i njegovih glavnih hemijskih komponenti protiv larvi komaraca i pokazuje kako prirodni spojevi u prahu sjemena krstašica mogu poslužiti kao obećavajući ekološki prihvatljiv larvicid za suzbijanje komaraca.
Vektorske bolesti uzrokovane komarcima vrste Aedes ostaju glavni globalni problem javnog zdravlja. Učestalost bolesti koje prenose komarci širi se geografski1,2,3 i ponovo se pojavljuje, što dovodi do izbijanja teških bolesti4,5,6,7. Širenje bolesti među ljudima i životinjama (npr. čikungunja, denga groznica, groznica Rift Valleyja, žuta groznica i virus Zika) je neviđeno. Samo denga groznica dovodi u rizik od infekcije približno 3,6 milijardi ljudi u tropima, s procijenjenih 390 miliona infekcija godišnje, što rezultira sa 6.100–24.300 smrtnih slučajeva godišnje8. Ponovna pojava i izbijanje virusa Zika u Južnoj Americi privukli su pažnju svijeta zbog oštećenja mozga koje uzrokuje kod djece rođene od zaraženih žena2. Kremer i saradnici3 predviđaju da će se geografski raspon komaraca Aedes nastaviti širiti i da će do 2050. godine polovina svjetske populacije biti u riziku od infekcije arbovirusima koje prenose komarci.
Sa izuzetkom nedavno razvijenih vakcina protiv denge i žute groznice, vakcine protiv većine bolesti koje prenose komarci još nisu razvijene9,10,11. Vakcine su još uvijek dostupne u ograničenim količinama i koriste se samo u kliničkim ispitivanjima. Kontrola komaraca vektora korištenjem sintetičkih insekticida bila je ključna strategija za kontrolu širenja bolesti koje prenose komarci12,13. Iako su sintetički pesticidi efikasni u ubijanju komaraca, kontinuirana upotreba sintetičkih pesticida negativno utiče na organizme koji nisu ciljna grupa i zagađuje okolinu14,15,16. Još alarmantniji je trend povećanja otpornosti komaraca na hemijske insekticide17,18,19. Ovi problemi povezani s pesticidima ubrzali su potragu za efikasnim i ekološki prihvatljivim alternativama za kontrolu vektora bolesti.
Različite biljke su razvijene kao izvori fitopesticida za suzbijanje štetočina20,21. Biljne supstance su uglavnom ekološki prihvatljive jer su biorazgradive i imaju nisku ili zanemarivu toksičnost za organizme koji nisu ciljna grupa, kao što su sisari, ribe i vodozemci20,22. Poznato je da biljni preparati proizvode razne bioaktivne spojeve s različitim mehanizmima djelovanja kako bi efikasno kontrolirali različite životne faze komaraca23,24,25,26. Spojevi biljnog porijekla, poput eteričnih ulja i drugih aktivnih biljnih sastojaka, privukli su pažnju i utrli put inovativnim alatima za kontrolu vektora komaraca. Eterična ulja, monoterpeni i seskviterpeni djeluju kao repelenti, sredstva za odvraćanje hranjenja i ovicidi27,28,29,30,31,32,33. Mnoga biljna ulja uzrokuju smrt larvi, kukuljica i odraslih komaraca34,35,36, utičući na nervni, respiratorni, endokrini i druge važne sisteme insekata37.
Nedavne studije pružile su uvid u potencijalnu upotrebu biljaka gorušice i njihovog sjemena kao izvora bioaktivnih spojeva. Brašno od sjemena gorušice testirano je kao biofumigant38,39,40,41 i korišteno je kao dodatak tlu za suzbijanje korova42,43,44 i kontrolu biljnih patogena koji se prenose zemljištem45,46,47,48,49,50, ishranu biljaka, nematode 41,51, 52, 53, 54 i štetočine 55, 56, 57, 58, 59, 60. Fungicidna aktivnost ovih prahova sjemena pripisuje se spojevima za zaštitu biljaka koji se nazivaju izotiocijanati38,42,60. U biljkama se ovi zaštitni spojevi skladište u biljnim ćelijama u obliku nebioaktivnih glukozinolata. Međutim, kada su biljke oštećene hranjenjem insektima ili infekcijom patogenima, glukozinolati se hidroliziraju mirozinazom u bioaktivne izotiocijanate55,61. Izotiocijanati su isparljivi spojevi poznati po širokom spektru antimikrobnog i insekticidnog djelovanja, a njihova struktura, biološka aktivnost i sadržaj uveliko variraju među vrstama Brassicaceae42,59,62,63.
Iako je poznato da izotiocijanati dobijeni iz brašna sjemenki gorušice imaju insekticidno djelovanje, nedostaju podaci o biološkoj aktivnosti protiv medicinski važnih vektora člankonožaca. Naša studija ispitala je larvicidno djelovanje četiri odmašćena praha sjemenki protiv komaraca Aedes. Larve Aedes aegypti. Cilj studije bio je procijeniti njihovu potencijalnu upotrebu kao ekološki prihvatljivih biopesticida za suzbijanje komaraca. Tri glavne hemijske komponente brašna sjemenki, alil izotiocijanat (AITC), benzil izotiocijanat (BITC) i 4-hidroksibenzilizotiocijanat (4-HBITC), također su testirane kako bi se testirala biološka aktivnost ovih hemijskih komponenti na larve komaraca. Ovo je prvi izvještaj koji procjenjuje efikasnost četiri praha sjemenki kupusa i njihovih glavnih hemijskih komponenti protiv larvi komaraca.
Laboratorijske kolonije Aedes aegypti (soj Rockefeller) održavane su na 26°C, 70% relativne vlažnosti (RH) i 10:14 h (L:D fotoperiod). Parene ženke su smještene u plastične kaveze (visine 11 cm i promjera 9,5 cm) i hranjene putem sistema za hranjenje na bočicu koristeći citratiranu goveđu krv (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, SAD). Hranjenje krvlju provedeno je kao i obično korištenjem membranske višestaklene hranilice (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, SAD) povezane s cijevi za cirkulirajuće vodeno kupatilo (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, SAD) s kontrolom temperature od 37°C. Razvucite film Parafilma M na dno svake staklene komore za hranjenje (površina 154 mm2). Svaka hranilica je zatim postavljena na gornju rešetku koja prekriva kavez u kojem se nalazila ženka koja se parila. Otprilike 350–400 μl goveđe krvi dodano je u stakleni lijevak za hranjenje pomoću Pasteurove pipete (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) i odrasli crvi su ostavljeni da se ocijede najmanje jedan sat. Gravidnim ženkama je zatim dan 10% rastvor saharoze i ostavljeno im je da polažu jaja na vlažni filter papir obložen u pojedinačne ultra-prozirne čašice za sufle (veličine 1,25 fl oz, Dart Container Corp., Mason, MI, SAD). Filter papir koji sadrži jaja stavite u zatvorenu vrećicu (SC Johnsons, Racine, WI) i čuvajte na 26°C. Jaja su se izlegla i otprilike 200–250 larvi je uzgojeno u plastičnim posudama koje su sadržavale mješavinu hrane za kuniće (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, SAD) i praha jetre (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, SAD) i ribljeg fileta (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Njemačka) u omjeru 2:1:1. U našim biološkim testovima korištene su larve kasnog trećeg instara.
Sjemenski materijal biljaka korišten u ovoj studiji dobiven je iz sljedećih komercijalnih i vladinih izvora: Brassica juncea (smeđa gorušica - Pacific Gold) i Brassica juncea (bijela gorušica - Ida Gold) od Pacific Northwest Farmers' Cooperative, država Washington, SAD; (vrtna potočarka) od Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, SAD i Thlaspi arvense (poljska potočarka - Elisabeth) od USDA-ARS, Peoria, IL, SAD; Nijedno sjeme korišteno u studiji nije tretirano pesticidima. Sav sjemenski materijal je obrađen i korišten u ovoj studiji u skladu s lokalnim i nacionalnim propisima i u skladu sa svim relevantnim lokalnim, državnim i nacionalnim propisima. Ova studija nije ispitivala transgene biljne sorte.
Sjemenke Brassica juncea (PG), Alfalfa (Ls), Bijela gorušica (IG) i Thlaspi arvense (DFP) samljevene su u fini prah korištenjem ultracentrifugalnog mlina Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Njemačka) opremljenog rupicama od 0,75 mm i rotorom od nehrđajućeg čelika, 12 zubaca, 10.000 o/min (Tabela 1). Prašak mljevenog sjemena prebačen je u papirnu posudu i odmašćen heksanom u Soxhlet aparatu tokom 24 sata. Poduzorak odmašćene poljske gorušice termički je tretiran na 100 °C tokom 1 sata kako bi se denaturirala mirozinaza i spriječila hidroliza glukozinolata usljed čega se formiraju biološki aktivni izotiocijanati. Termički tretiran prah sjemena preslice (DFP-HT) korišten je kao negativna kontrola denaturacijom mirozinaze.
Sadržaj glukozinolata u odmašćenom sjemenskom brašnu određen je u tri primjerka korištenjem visokoefikasne tekućinske kromatografije (HPLC) prema prethodno objavljenom protokolu 64. Ukratko, 3 mL metanola dodano je u uzorak od 250 mg odmašćenog sjemenskog praha. Svaki uzorak je soniciran u vodenom kupatilu 30 minuta i ostavljen u mraku na 23°C tokom 16 sati. Alikvot od 1 mL organskog sloja zatim je filtriran kroz filter od 0,45 μm u automatski uzorkivač. Radeći na Shimadzu HPLC sistemu (dvije LC 20AD pumpe; automatski uzorkivač SIL 20A; degazator DGU 20As; UV-VIS detektor SPD-20A za praćenje na 237 nm; i komunikacijski modul CBM-20A), sadržaj glukozinolata u sjemenskom brašnu određen je u tri primjerka korištenjem Shimadzu LC Solution softvera verzije 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, SAD). Kolona je bila C18 Inertsil kolona reverzne faze (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, SAD). Početni uslovi mobilne faze postavljeni su na 12% metanola/88% 0,01 M tetrabutilammonijum hidroksida u vodi (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) sa brzinom protoka od 1 mL/min. Nakon injektiranja 15 μl uzorka, početni uslovi su održavani 20 minuta, a zatim je omjer rastvarača podešen na 100% metanola, sa ukupnim vremenom analize uzorka od 65 minuta. Standardna krivulja (na bazi nM/mAb) generirana je serijskim razrjeđivanjem svježe pripremljenih standarda sinapina, glukozinolata i mirozina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) kako bi se procijenio sadržaj sumpora u odmašćenom sjemenskom brašnu. Koncentracije glukozinolata u uzorcima testirane su na Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA, SAD) korištenjem OpenLAB CDS ChemStation verzije (C.01.07 SR2 [255]) opremljene istom kolonom i korištenjem prethodno opisane metode. Koncentracije glukozinolata određene su; treba ih usporediti između HPLC sistema.
Alil izotiocijanat (94%, stabilan) i benzil izotiocijanat (98%) su kupljeni od Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). 4-Hidroksibenzilizotiocijanat je kupljen od ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, SAD). Kada se enzimski hidrolizuju mirozinazom, glukozinolati, glukozinolati i glukozinolati formiraju alil izotiocijanat, benzil izotiocijanat i 4-hidroksibenzilizotiocijanat, respektivno.
Laboratorijski biološki testovi provedeni su prema metodi Muturija i suradnika 32 s modifikacijama. U studiji je korišteno pet vrsta sjemenske hrane s niskim udjelom masti: DFP, DFP-HT, IG, PG i Ls. Dvadeset larvi je smješteno u jednokratnu čašu s tri smjera od 400 mL (VWR International, LLC, Radnor, PA, SAD) koja je sadržavala 120 mL deionizirane vode (dH2O). Sedam koncentracija sjemenskog brašna testirano je na toksičnost za larve komaraca: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 i 0,12 g sjemenskog brašna/120 ml dH2O za DFP sjemensko brašno, DFP-HT, IG i PG. Preliminarni biološki testovi pokazuju da je obezmašćeno sjemensko brašno Ls toksičnije od četiri druga testirana sjemenska brašna. Stoga smo prilagodili sedam koncentracija sjemenskog brašna Ls za tretman na sljedeće koncentracije: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 i 0,075 g/120 mL dH2O.
Netretirana kontrolna grupa (dH20, bez dodatka sjemenskog brašna) uključena je radi procjene normalne smrtnosti insekata pod uslovima ispitivanja. Toksikološki biološki testovi za svako sjemensko brašno uključivali su tri ponovljena čaše s tri nagiba (20 larvi kasnog trećeg stadija po čaši), za ukupno 108 bočica. Tretirane posude su čuvane na sobnoj temperaturi (20-21°C), a smrtnost larvi je zabilježena tokom 24 i 72 sata kontinuiranog izlaganja koncentracijama tretmana. Ako se tijelo i dodaci komarca ne pomiču kada se probuše ili dodirnu tankom špatulom od nehrđajućeg čelika, larve komaraca se smatraju mrtvima. Mrtve larve obično ostaju nepokretne u dorzalnom ili ventralnom položaju na dnu posude ili na površini vode. Eksperiment je ponovljen tri puta u različitim danima koristeći različite grupe larvi, za ukupno 180 larvi izloženih svakoj koncentraciji tretmana.
Toksičnost AITC-a, BITC-a i 4-HBITC-a za larve komaraca procijenjena je korištenjem istog postupka biološkog testa, ali s različitim tretmanima. Pripremite osnovne rastvore od 100.000 ppm za svaku hemikaliju dodavanjem 100 µL hemikalije u 900 µL apsolutnog etanola u epruvetu za centrifugu od 2 mL i protresite 30 sekundi da se dobro promiješa. Koncentracije tretmana određene su na osnovu naših preliminarnih bioloških testova, koji su pokazali da je BITC mnogo toksičniji od AITC-a i 4-HBITC-a. Za određivanje toksičnosti korišteno je 5 koncentracija BITC-a (1, 3, 6, 9 i 12 ppm), 7 koncentracija AITC-a (5, 10, 15, 20, 25, 30 i 35 ppm) i 6 koncentracija 4-HBITC-a (15, 15, 20, 25, 30 i 35 ppm, odnosno 30, 45, 60, 75 i 90 ppm). Kontrolnom tretmanu je ubrizgano 108 μL apsolutnog etanola, što je ekvivalentno maksimalnoj zapremini hemijskog tretmana. Biološki testovi su ponovljeni kao gore navedeno, izlažući ukupno 180 larvi po koncentraciji tretmana. Mortalitet larvi je zabilježen za svaku koncentraciju AITC, BITC i 4-HBITC nakon 24 sata kontinuiranog izlaganja.
Probit analiza 65 podataka o mortalitetu povezanom s dozom provedena je korištenjem Polo softvera (Polo Plus, LeOra Software, verzija 1.0) kako bi se izračunala 50% letalna koncentracija (LC50), 90% letalna koncentracija (LC90), nagib, koeficijent letalne doze i 95% letalna koncentracija, na osnovu intervala pouzdanosti za omjere letalnih doza za logaritamski transformirane krive koncentracije i doze-mortaliteta. Podaci o mortalitetu zasnovani su na kombinovanim ponovljenim podacima 180 larvi izloženih svakoj koncentraciji tretmana. Probabilističke analize su provedene odvojeno za svaki obrok sjemena i svaku hemijsku komponentu. Na osnovu 95% intervala pouzdanosti omjera letalne doze, toksičnost obroka sjemena i hemijskih sastojaka za larve komaraca smatrana je značajno različitom, tako da interval pouzdanosti koji sadrži vrijednost 1 nije bio značajno drugačiji, P = 0,0566.
Rezultati HPLC-a za određivanje glavnih glukozinolata u obezmašćenom brašnu sjemena DFP, IG, PG i Ls navedeni su u Tabeli 1. Glavni glukozinolati u testiranom brašnu sjemena varirali su, s izuzetkom DFP i PG, koji su oba sadržavali mirozinazne glukozinolate. Sadržaj mirozinina u PG bio je veći nego u DFP, 33,3 ± 1,5 odnosno 26,5 ± 0,9 mg/g. Prašak sjemena Ls sadržavao je 36,6 ± 1,2 mg/g glukoglikona, dok je prah sjemena IG sadržavao 38,0 ± 0,5 mg/g sinapina.
Larve komaraca *Ae. Aedes aegypti* su ubijene kada su tretirane odmašćenim sjemenskim brašnom, iako je efikasnost tretmana varirala u zavisnosti od vrste biljke. Samo DFP-NT nije bio toksičan za larve komaraca nakon 24 i 72 sata izlaganja (Tabela 2). Toksičnost aktivnog sjemenskog praha povećavala se s povećanjem koncentracije (Slika 1A, B). Toksičnost sjemenskog brašna za larve komaraca značajno je varirala na osnovu 95% CI odnosa letalne doze LC50 vrijednosti pri 24-satnim i 72-satnim procjenama (Tabela 3). Nakon 24 sata, toksični efekat sjemenskog brašna *Ls* bio je veći nego kod drugih tretmana sjemenskim brašnom, sa najvećom aktivnošću i maksimalnom toksičnošću za larve (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Larve su bile manje osjetljive na DFP nakon 24 sata u poređenju sa tretmanima sjemenskog praha IG, Ls i PG, sa LC50 vrijednostima od 0,115, 0,04 i 0,08 g/120 ml dH2O respektivno, što je bilo statistički više od LC50 vrijednosti od 0,211 g/120 ml dH2O (Tabela 3). LC90 vrijednosti DFP, IG, PG i Ls bile su 0,376, 0,275, 0,137 i 0,074 g/120 ml dH2O, respektivno (Tabela 2). Najviša koncentracija DPP bila je 0,12 g/120 ml dH2O. Nakon 24 sata procjene, prosječna smrtnost larvi bila je samo 12%, dok je prosječna smrtnost larvi IG i PG dostigla 51% odnosno 82%. Nakon 24 sata evaluacije, prosječna smrtnost larvi za tretman sjemenskim brašnom Ls s najvećom koncentracijom (0,075 g/120 ml dH2O) bila je 99% (Slika 1A).
Krive mortaliteta procijenjene su na osnovu odgovora na dozu (Probit) larvi Ae. Egyptian (larve 3. instara) na koncentraciju sjemenskog brašna 24 sata (A) i 72 sata (B) nakon tretmana. Isprekidana linija predstavlja LC50 tretmana sjemenskim brašnom. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Termički inaktivirani Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Pri 72-satnoj evaluaciji, vrijednosti LC50 za DFP, IG i PG sjemenski obrok iznosile su 0,111, 0,085 i 0,051 g/120 ml dH2O, respektivno. Gotovo sve larve izložene sjemenskom obroku Ls uginule su nakon 72 sata izlaganja, tako da podaci o smrtnosti nisu bili u skladu s Probit analizom. U poređenju s drugim sjemenskim obrokom, larve su bile manje osjetljive na tretman sjemenskim obrokom DFP i imale su statistički više LC50 vrijednosti (Tabele 2 i 3). Nakon 72 sata, vrijednosti LC50 za tretmane sjemenskim obrokom DFP, IG i PG procijenjene su na 0,111, 0,085 i 0,05 g/120 ml dH2O, respektivno. Nakon 72 sata evaluacije, vrijednosti LC90 za DFP, IG i PG sjemenski prah iznosile su 0,215, 0,254 i 0,138 g/120 ml dH2O, respektivno. Nakon 72 sata evaluacije, prosječna smrtnost larvi za tretmane sjemenskog brašna DFP, IG i PG pri maksimalnoj koncentraciji od 0,12 g/120 ml dH2O iznosila je 58%, 66% i 96%, respektivno (Slika 1B). Nakon 72 sata evaluacije, utvrđeno je da je sjemensko brašno PG toksičnije od sjemenskog brašna IG i DFP.
Sintetički izotiocijanati, alil izotiocijanat (AITC), benzil izotiocijanat (BITC) i 4-hidroksibenzilizotiocijanat (4-HBITC) mogu efikasno ubiti larve komaraca. 24 sata nakon tretmana, BITC je bio toksičniji za larve sa LC50 vrijednošću od 5,29 ppm u poređenju sa 19,35 ppm za AITC i 55,41 ppm za 4-HBITC (Tabela 4). U poređenju sa AITC i BITC, 4-HBITC ima nižu toksičnost i višu LC50 vrijednost. Postoje značajne razlike u toksičnosti za larve komaraca dva glavna izotiocijanata (Ls i PG) u najpotentnijem sjemenskom obroku. Toksičnost zasnovana na odnosu letalnih doza LC50 vrijednosti između AITC, BITC i 4-HBITC pokazala je statističku razliku tako da 95% CI odnosa letalnih doza LC50 nije uključivao vrijednost od 1 (P = 0,05, Tabela 4). Procijenjeno je da najviše koncentracije i BITC-a i AITC-a ubijaju 100% testiranih larvi (Slika 2).
Krive mortaliteta procijenjene su na osnovu doze i odgovora (Probit) Ae. 24 sata nakon tretmana, egipatske larve (larve 3. instara) dostigle su koncentracije sintetičkog izotiocijanata. Isprekidana linija predstavlja LC50 za tretman izotiocijanatom. Benzil izotiocijanat BITC, alil izotiocijanat AITC i 4-HBITC.
Upotreba biljnih biopesticida kao sredstava za suzbijanje komaraca vektora dugo se proučava. Mnoge biljke proizvode prirodne hemikalije koje imaju insekticidno djelovanje37. Njihovi bioaktivni spojevi pružaju atraktivnu alternativu sintetičkim insekticidima s velikim potencijalom u suzbijanju štetočina, uključujući komarce.
Biljke gorušice se uzgajaju kao kultura zbog sjemena, koriste se kao začin i izvor ulja. Kada se ulje gorušice ekstrahira iz sjemena ili kada se gorušica ekstrahira za upotrebu kao biogorivo, 69 nusproizvod je odmašćeno sjemensko brašno. Ovo sjemensko brašno zadržava mnoge svoje prirodne biohemijske komponente i hidrolitičke enzime. Toksičnost ovog sjemenskog brašna pripisuje se proizvodnji izotiocijanata55,60,61. Izotiocijanati nastaju hidrolizom glukozinolata enzimom mirozinazom tokom hidratacije sjemenskog brašna38,55,70 i poznato je da imaju fungicidne, baktericidne, nematocidne i insekticidne efekte, kao i druga svojstva, uključujući hemijske senzorne efekte i hemoterapijska svojstva61,62,70. Nekoliko studija je pokazalo da biljke gorušice i sjemensko brašno djeluju efikasno kao fumiganti protiv štetočina u tlu i uskladištene hrane57,59,71,72. U ovoj studiji procijenili smo toksičnost sačme od četiri sjemenke i njena tri bioaktivna proizvoda AITC, BITC i 4-HBITC na larve komaraca Aedes. Aedes aegypti. Očekuje se da će dodavanje sačme direktno u vodu koja sadrži larve komaraca aktivirati enzimske procese koji proizvode izotiocijanate koji su toksični za larve komaraca. Ova biotransformacija je dijelom demonstrirana uočenom larvicidnom aktivnošću sačme i gubitkom insekticidne aktivnosti kada je sačma patuljaste gorušice termički obrađena prije upotrebe. Očekuje se da će termička obrada uništiti hidrolitičke enzime koji aktiviraju glukozinolate, čime se sprječava stvaranje bioaktivnih izotiocijanata. Ovo je prva studija koja potvrđuje insekticidna svojstva praha sjemenki kupusa protiv komaraca u vodenom okruženju.
Među testiranim prahom sjemena, prah sjemena potočarke (Ls) bio je najtoksičniji, uzrokujući visoku smrtnost Aedes albopictus. Larve Aedes aegypti su kontinuirano obrađene 24 sata. Preostala tri praha sjemena (PG, IG i DFP) imala su sporiju aktivnost i dalje su uzrokovala značajnu smrtnost nakon 72 sata kontinuiranog tretmana. Samo je sačma sjemena Ls sadržavala značajne količine glukozinolata, dok su PG i DFP sadržavali mirozinazu, a IG glukozinolat kao glavni glukozinolat (Tabela 1). Glukotropaeolin se hidrolizira u BITC, a sinalbin se hidrolizira u 4-HBITC61,62. Naši rezultati biološkog testa pokazuju da su i sačma sjemena Ls i sintetički BITC vrlo toksični za larve komaraca. Glavna komponenta sačme sjemena PG i DFP je mirozinaza glukozinolat, koji se hidrolizira u AITC. AITC je efikasan u ubijanju larvi komaraca sa LC50 vrijednošću od 19,35 ppm. U poređenju sa AITC-om i BITC-om, 4-HBITC izotiocijanat je najmanje toksičan za larve. Iako je AITC manje toksičan od BITC-a, njihove LC50 vrijednosti su niže od mnogih eteričnih ulja testiranih na larvama komaraca32,73,74,75.
Naš prah sjemena krstašica za upotrebu protiv larvi komaraca sadrži jedan glavni glukozinolat, koji čini preko 98-99% ukupnih glukozinolata, određeno HPLC-om. Otkrivene su tragove drugih glukozinolata, ali su njihovi nivoi bili manji od 0,3% ukupnih glukozinolata. Prah sjemena potočarke (L. sativum) sadrži sekundarne glukozinolate (sinigrin), ali njihov udio je 1% ukupnih glukozinolata, a njihov sadržaj je i dalje beznačajan (oko 0,4 mg/g praha sjemena). Iako PG i DFP sadrže isti glavni glukozinolat (mirozin), larvicidna aktivnost njihovih sjemenskih obroka značajno se razlikuje zbog njihovih LC50 vrijednosti. Varira u toksičnosti za pepelnicu. Pojava larvi Aedes aegypti može biti posljedica razlika u aktivnosti mirozinaze ili stabilnosti između dva sjemenska obroka. Aktivnost mirozinaze igra važnu ulogu u bioraspoloživosti produkata hidrolize kao što su izotiocijanati u biljkama Brassicaceae76. Prethodni izvještaji Pococka i suradnika77 i Wilkinsona i suradnika78 pokazali su da promjene u aktivnosti i stabilnosti mirozinaze mogu biti povezane i s genetskim i okolišnim faktorima.
Očekivani sadržaj bioaktivnih izotiocijanata izračunat je na osnovu LC50 vrijednosti svakog sjemenskog obroka nakon 24 i 72 sata (Tabela 5) radi poređenja sa odgovarajućim hemijskim primjenama. Nakon 24 sata, izotiocijanati u sjemenskom obroku bili su toksičniji od čistih jedinjenja. LC50 vrijednosti izračunate na osnovu dijelova na milion (ppm) tretmana sjemena izotiocijanatom bile su niže od LC50 vrijednosti za primjene BITC, AITC i 4-HBITC. Posmatrali smo larve kako konzumiraju pelete sjemenskog obroka (Slika 3A). Posljedično, larve mogu biti izložene koncentrisanijim toksičnim izotiocijanatima gutanjem peleta sjemenskog obroka. Ovo je bilo najočiglednije kod tretmana sjemenskog obroka IG i PG pri 24-satnoj izloženosti, gdje su koncentracije LC50 bile 75% i 72% niže od tretmana čistim AITC i 4-HBITC. Tretmani Ls i DFP bili su toksičniji od čistog izotiocijanata, sa LC50 vrijednostima nižim za 24% i 41%. Larve u kontrolnom tretmanu su se uspješno ukukuljile (Sl. 3B), dok se većina larvi u tretmanu sjemenskim brašnom nije ukukuljila, a razvoj larvi je bio značajno odgođen (Sl. 3B,D). Kod Spodopteralitura, izotiocijanati su povezani sa zastojem u rastu i razvojnim kašnjenjem79.
Larve komaraca vrste Ae. Aedes aegypti bile su kontinuirano izložene prahu sjemena Brassica tokom 24-72 sata. (A) Mrtve larve sa česticama sjemenskog brašna u ustima (zaokruženo); (B) Kontrolni tretman (dH20 bez dodatka sjemenskog brašna) pokazuje da larve normalno rastu i počinju se kukuljiti nakon 72 sata (C, D) Larve tretirane sjemenskim brašnom; sjemensko brašno pokazalo je razlike u razvoju i nije se kukuljilo.
Nismo proučavali mehanizam toksičnih efekata izotiocijanata na larve komaraca. Međutim, prethodne studije na crvenim vatrenim mravima (Solenopsis invicta) pokazale su da je inhibicija glutation S-transferaze (GST) i esteraze (EST) glavni mehanizam bioaktivnosti izotiocijanata, a AITC, čak i pri niskoj aktivnosti, također može inhibirati aktivnost GST. crveni uvezeni vatreni mravi u niskim koncentracijama. Doza je 0,5 µg/ml80. Nasuprot tome, AITC inhibira acetilkolinesterazu kod odraslih kukuruznih žižaka (Sitophilus zeamais)81. Slične studije moraju se provesti kako bi se razjasnio mehanizam aktivnosti izotiocijanata kod larvi komaraca.
Koristimo tretman DFP-a inaktiviranim toplinom kako bismo podržali prijedlog da hidroliza biljnih glukozinolata u svrhu stvaranja reaktivnih izotiocijanata služi kao mehanizam za kontrolu larvi komaraca pomoću sačme sjemena gorušice. DFP-HT sačma sjemena nije bila toksična pri testiranim količinama primjene. Lafarga i suradnici 82 izvijestili su da su glukozinolati osjetljivi na degradaciju na visokim temperaturama. Očekuje se da će toplinska obrada također denaturirati enzim mirozinazu u sačmi sjemena i spriječiti hidrolizu glukozinolata u svrhu stvaranja reaktivnih izotiocijanata. To su također potvrdili Okunade i suradnici 75 koji su pokazali da je mirozinaza osjetljiva na temperaturu, pokazujući da je aktivnost mirozinaze potpuno inaktivirana kada su sjemenke gorušice, crne gorušice i krvavog korijena izložene temperaturama iznad 80°C. Ovi mehanizmi mogu rezultirati gubitkom insekticidne aktivnosti toplinski tretirane sačme sjemena DFP.
Dakle, brašno od sjemenki gorušice i njegova tri glavna izotiocijanata su toksični za larve komaraca. S obzirom na ove razlike između brašna od sjemenki i hemijskih tretmana, upotreba brašna od sjemenki gorušice može biti efikasna metoda suzbijanja komaraca. Postoji potreba za identifikacijom odgovarajućih formulacija i efikasnih sistema isporuke kako bi se poboljšala efikasnost i stabilnost upotrebe praha sjemena. Naši rezultati ukazuju na potencijalnu upotrebu brašna od sjemenki gorušice kao alternative sintetičkim pesticidima. Ova tehnologija bi mogla postati inovativan alat za suzbijanje vektora komaraca. Budući da larve komaraca uspijevaju u vodenim okruženjima, a glukozinolati iz brašna od sjemena gorušice se enzimski pretvaraju u aktivne izotiocijanate nakon hidratacije, upotreba brašna od sjemenki gorušice u vodi zaraženoj komarcima nudi značajan potencijal suzbijanja. Iako larvicidna aktivnost izotiocijanata varira (BITC > AITC > 4-HBITC), potrebna su daljnja istraživanja kako bi se utvrdilo da li kombinovanje brašna od sjemena gorušice sa više glukozinolata sinergistički povećava toksičnost. Ovo je prva studija koja pokazuje insekticidne efekte obezmašćenog brašna od sjemenki krstašica i tri bioaktivna izotiocijanata na komarce. Rezultati ove studije otvaraju nove puteve pokazujući da sačma od obezmašćenog sjemena kupusa, nusproizvod ekstrakcije ulja iz sjemena, može poslužiti kao obećavajuće larvicidno sredstvo za suzbijanje komaraca. Ove informacije mogu pomoći u daljem otkrivanju sredstava za biokontrolu biljaka i njihovom razvoju kao jeftinih, praktičnih i ekološki prihvatljivih biopesticida.
Skupovi podataka generirani za ovu studiju i rezultirajuće analize dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev. Na kraju studije, svi materijali korišteni u studiji (insekti i sjemenska sačma) su uništeni.
Vrijeme objave: 29. jula 2024.